[发明专利]一种启动子组合控制的动态调控系统

权利要求书

1.一种基因工程菌，其特征在于，引入了含有生长期关联启动子的表达载体和含有稳定期关联启动子的表达载体；所述生长期关联启动子连有添加了N末端的蛋白酶识别切割位点的靶蛋白；所述稳定期关联启动子连有蛋白酶；所述N末端的蛋白酶识别切割位点被所述蛋白酶识别；所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主；所述生长期关联启动子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；

所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；

所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述靶蛋白为莽草酸激酶。

3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，稳定期关联启动子连有的蛋白酶为TEV蛋白酶。

4.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，以PJ01-GABE-GPP-K和P_SPP-TEV为表达载体；

所述的PJ01-GABE-GPP-K质粒的构建方法为：

（1）以商业化质粒pTargetF为基础，采用全质粒PCR的方式，在rrnB T1 终止子后插入T7Te终止子序列，以减少泄露表达；进一步地，采用全质粒PCR的方式，去除sgRNA表达框，获得仅含有Pj23119组成型启动子和双终止的工程质粒pJ01；

（2）以大肠杆菌MG1655基因组为模板，分别扩增获得含有B0034RBS的aro^Bopt、aroE、aroG^fbr、tktA片段，将aro^Bopt、aroE两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-BE质粒，以相同的方法，将aroG^fbr、tktA两个片段采用多片段一步同源重组的方式，插入至pJ01的表达框中，获得pJ01-GA质粒；

（3）以大肠杆菌MG1655基因组为模板，扩增获得含有B0034RBS、N末端修饰的aroK片段，将该片段插入至pJ01质粒中，获得pJ01-K质粒，利用酶切位点BglII和SpeI双酶切质粒pJ01-K，并以相同的酶切位点插入合成生长关联启动子序列，获得GPP-K质粒；

（4）采用同尾酶连接的方式利用BamHI、BglII和XbaI，分别将pJ01-GA、pJ01-BE、GPP-K质粒组装，最终获得质粒PJ01-GABE-GPP-K；

所述的P_SPP-TEV质粒的构建方法为：

合成稳定期关联启动子基因后，采用融合PCR的方式分别加上B0034RBS及GFP报告基因，将上述融合后的片段与载体pTet-1质粒连接，构建获得重组质粒P_SPP-GFP；使用蛋白酶TEV基因片段置换上述P_SPP-GFP中的报告基因GFP，获得质粒P_SPP-TEV质粒；所述载体pTet-1来源于商业化质粒pdCas9-bacteria，采用全质粒PCR的方式将pdCas9-bacteria中编码dcas9蛋白的序列删除，获得的质粒重新命名为pTet-1。

5.一种调控靶蛋白基因表达的方法，其特征在于，用生长期关联启动子关联连有添加了N末端的蛋白酶识别切割位点的靶蛋白表达，并用稳定期关联启动子关联蛋白酶的表达；所述N末端的蛋白酶识别切割位点被所述蛋白酶识别；

所述生长期关联启动子包括rrnB P1、rpsT P2或rpsJ；

所述稳定期关联启动子包括fic、bolA、S4或S60；

所述rrnB P1、rpsT P2、rpsJ、fic、bolA、S4、S60的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2-SEQID NO.8所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶为TEV蛋白酶。