[发明专利]一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及其应用。所述探针为DNA/RNA杂合探针，其中DNA链上带有一脱碱基位点，该脱碱基位点的5’侧为G碱基，3’侧连续存在两个错配碱基，形成一悬出区；在悬出区两侧的DNA链上分别标记有荧光基团和猝灭基团。APE1可以识别和切割该DNA链上脱碱基位点5’方向的磷酸酯键，将DNA链一分为二，从而使荧光基团发出荧光信号，实现在复杂的生物样品环境中对APE1含量的直接检测。相比于现有的荧光分析方法，本发明在探针结构和反应溶液配方上都有重大改进，灵敏度更高，检测结果更加准确可靠，而且试剂成本更低，稳定性更好。

技术领域

本发明涉及脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)的分析检测领域，更具体地，涉及一种基于寡聚核苷酸荧光探针的检测试剂盒，以及利用该试剂盒检测生物样品中APE1含量的方法。

背景技术

人类脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，简称APE1)，又称氧化还原因子-1(redox effector factor-1，简称Ref-1)，是人体中的一种重要的DNA修复蛋白与基因调控蛋白。一方面，它作用于DNA双链中的脱嘌呤/脱嘧啶位点(apurinic/apyrimidinic sites，简称脱碱基位点)，是人体内最为重要的脱碱基核酸修复酶，在碱基切除修复途径(base excision repair，BER)中发挥重要作用；另一方面，APE1还能通过其氧化还原功能调控多种转录因子的DNA结合活性。

已有研究表明，APE1在多种癌细胞中出现表达异常的情况，包括蛋白表达水平和在细胞内定位的变化。在宫颈癌、前列腺癌和肺癌等癌细胞中，APE1的表达水平明显高于正常细胞。另外一些癌症，如乳腺癌，APE1的表达水平变化不大，但在癌细胞的细胞质和细胞核内的分布状况与正常细胞明显不同。临床样品的检测结果发现，血清中APE1的含量会由于一些癌症的发生而变化，例如在膀胱癌、肺癌等癌症患者中，血清APE1水平相比于正常人群有明显升高。特别是血清APE1水平的高低还与靶向药物治疗的预后表现出密切的相关性。因此，对生物样本(血液、组织提取液、细胞裂解液等)中的APE1含量进行定量检测，对于临床癌症的诊断和治疗有重要的指导意义，还可为研究基因损伤修复与疾病发生发展之间的关系提供有力的工具。

现有的检测APE1的方法有电化学分析法^[1]、凝胶电泳法^[2]、酶联免疫吸附分析法^[3]、液质联用法^[4,5]和荧光分析法^[6,7]等。其中凝胶电泳方法操作步骤繁琐，定量能力差。电化学分析法重现性不够好。液质联用方法必需先进行样品纯化富集^[4](凝胶电泳分离、切胶纯化、蛋白酶解等)，且由于方法灵敏度有限，需要的血液样本体积上百毫升，难以用于临床检测。免疫分析法可以用于实际样品的检测，但由于血清中APE1自抗体的干扰，检测结果的可靠性不足。与上述方法相比，荧光分析法具有操作步骤简单、灵敏度高、重现性好等优点。我们在之前的工作中开发了一种APE1的荧光检测方法^[7]，可以直接用于血清中较高浓度APE1的定量测定。但是，对于APE1含量较低的血清样品，该方法灵敏度不够。当用于细胞裂解液中APE1含量的测定时，方法的回收率偏高，表明样品中有活性物质干扰了探针对APE1的响应。因此，迫切需要开发出一种灵敏度更高、抗干扰能力更强的荧光分析方法，实现对各种生物样品中APE1含量准确可靠的检测。

参考文献：

[1]Han,et al.,Biosensors and Bioelectronics,2013,vol.41,p.116～122.

[2]Kreklau,et al.,Nucleic Acids Research,2001,vol.29,p.2558～2566.

[3]Zhang,et al.,Oncotarget,2016,vol.7,p.77482～77494.