[发明专利]一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测探针、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种脱碱基核酸内切酶1探针，为两边3’末端突出的DNA/RNA杂合探针，其中DNA链的3’末端突出至少6个碱基，RNA链的3’末端突出至少2个碱基；DNA链上带有一脱碱基位点，该脱碱基位点的5’侧为G碱基，3’侧连续存在两个错配碱基；该脱碱基位点及其3’侧的两个错配碱基与RNA链不能互补配对，形成一悬出区，在所述悬出区两侧的DNA/RNA互补碱基对分别至少为连续7对；在悬出区两侧的DNA链上分别标记有荧光基团和猝灭基团，荧光基团和猝灭基团之间的距离不超过20个碱基，且荧光基团和猝灭基团各自距离所述悬出区至少4个碱基。

2.如权利要求1所述的脱碱基核酸内切酶1探针，其特征在于，所述探针的DNA链的序列如序列表中SEQ ID No：1所示，RNA链的序列如序列表中SEQ ID No：2所示，其中，荧光基团标记在位于SEQ ID No：1第1位的脱氧核糖核苷酸残基上，猝灭基团标记在位于SEQ ID No：1第14位的脱氧核糖核苷酸残基上；所述荧光基团和相应的猝灭基团选自下列组合中的一种：FAM和BHQ1/DABCYL/TAMRA，TET和BHQ1/DABCYL，HEX和BHQ1/BHQ2/DABCYL，TAMRA和BHQ2，ROX和BHQ2，Texas Red和BHQ2，Cy5和BHQ2/BHQ3。

3.一种脱碱基核酸内切酶1的荧光检测试剂盒，包括权利要求1或2所述的脱碱基核酸内切酶1探针和试剂A，所述试剂A是荧光分析所用的反应缓冲液，含有40-60mM KAc、15-25mM Tris-Ac、8-12mM Mg(Ac)₂，以及巯基类还原剂和非离子表面活性剂，pH7.6-8.2。

4.如权利要求3所述的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述巯基类还原剂选自下列还原剂中的一种或多种：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇和三-(2-甲酰乙基)膦盐酸盐；所述非离子表面活性剂是Triton X-100或Tween-20。

5.如权利要求3所述的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂A含有40-60mM KAc、15-25mM Tris-Ac、8-12mM Mg(Ac)₂、0.5-1.5mM DTT或2-5％BME、0.02％-0.1％Triton X-100或Tween-20、2-8μg/mL生物素抗体，pH7.6-8.2。

6.如权利要求3所述的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述荧光检测试剂盒还包括试剂B和APE1标准品，所述试剂B为0.02％-0.1％(v/v)Triton X-100溶液。

7.一种检测样品中脱碱基核酸内切酶1浓度的方法，包括以下步骤：

1)在反应缓冲液中加入一定量的权利要求1或2所述的脱碱基核酸内切酶1探针，并分别加入不同浓度的脱碱基核酸内切酶1标准溶液，立即进行实时荧光检测，根据荧光强度随时间的变化曲线得到荧光上升速率，即为不同浓度下脱碱基核酸内切酶1对探针的水解效率，得到不同浓度脱碱基核酸内切酶1对应荧光上升速率的工作曲线；

2)在反应缓冲液中同样加入一定量的权利要求1或2所述的脱碱基核酸内切酶1探针，并加入待测样品，立即进行实时荧光检测，根据荧光强度随时间的变化曲线得到荧光上升速率，与步骤1)测定的工作曲线相比较，得到样品中脱碱基核酸内切酶1的浓度。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)中所述反应缓冲液含有40-60mM KAc、15-25mM Tris-Ac、8-12mM Mg(Ac)₂，以及巯基类还原剂和非离子表面活性剂，pH7.6-8.2。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)和步骤2)的检测温度为37℃，所述反应缓冲液含有40-60mM KAc、15-25mM Tris-Ac、8-12mM Mg(Ac)₂、0.5-1.5mM DTT或2-5％BME、0.02％-0.1％Triton X-100或Tween-20、2-8μg/mL生物素抗体，pH7.6-8.2。