[发明专利]一种突变体DNA聚合酶及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种分离的突变体DNA聚合酶及其制备方法和应用，所述突变体DNA聚合酶为如下（1）或（2）的蛋白质：（1）氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；（2）与（1）中所述蛋白质具有至少80%同源性、且具有（1）中所述蛋白质功能的蛋白质。本发明中的突变体DNA聚合酶的血液耐受性优于野生型，可用于免核酸提取的直接扩增PCR反应体系中，例如在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中。

技术领域

本发明涉及生物学领域，特别是涉及一种突变体DNA聚合酶及其制备方法和应用。

背景技术

传统的PCR是将样本中的DNA提取纯化之后进行扩增，实际应用时，提取纯化DNA需要消耗大量的时间，并且可能导致目的基因的丢失，所以市场更需要能够用于直接扩增样本的Taq DNA聚合酶。而未经DNA提取纯化的样本中含有很多抑制剂会严重抑制PCR反应，含有较强抑制剂的样本主要包括血液、土壤等。其中的抑制剂主要作用于Taq DNA聚合酶，主要是通过降低酶的延伸速度，也有报道说主要是与DNA聚合酶的失活或靶DNA和引物的捕获或降解相关。

用血液进行直接PCR广泛应用于诊断和法医分析，例如：遗传病的诊断、微生物和病毒感染的诊断、血型分析、环境检测、人类DNA鉴定等。血液对PCR有很强的抑制作用，目前广泛使用的Taq DNA聚合酶在0.2％的全血液存在下就不能扩增了。因此，需要对上述抑制剂更具抗性且适用于使用血样的PCR反应的试剂，如DNA聚合酶。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供一种突变体DNA聚合酶及其制备方法和应用。

本发明的第一方面，提供一种分离的突变体DNA聚合酶，其特征在于，所述突变体DNA聚合酶为如下(1)或(2)的蛋白质：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

(2)与(1)中所述蛋白质具有至少80％同源性，且能在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中发挥DNA聚合酶功能。

本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码如本发明的第一方面所述的突变体DNA聚合酶。

本发明的第三方面，提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有如本发明的第二方面所述的分离的多核苷酸。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞所述细胞含有如本发明的第三方面所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的如本发明的第二方面所述的分离的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供一种制备如本发明的第一方面所述的突变体DNA聚合酶的方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养如本发明的第四方面所述的宿主细胞，使之表达所述突变体DNA聚合酶。

本发明的第六方面，提供一种如本发明的第一方面所述的突变体DNA聚合酶的纯化方法，包括如下步骤：

(i)将表达目的蛋白的宿主细胞离心，重悬后用溶菌酶进行处理；

(ii)水浴，离心，弃沉淀，收集上清液一；

(iii)去除上清液一中的核酸和其他杂质，离心，收集上清液二；

(iv)加入离子交换柱缓冲液，过滤，过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，进行蛋白质的分离，得到目的蛋白。

本发明的第七方面，提供一种如本发明的第一方面所述的突变体DNA聚合酶在扩增靶核酸中的用途。所述靶核酸包含在含有血液、血浆、血清、血红蛋白和/或红血素的样本中。

本发明的第八方面，提供一种扩增靶核酸的方法，该方法包括：扩增时采用的DNA聚合酶为如本发明的第一方面所述的突变体DNA聚合酶。