[发明专利]一种突变体DNA聚合酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种分离的突变体DNA聚合酶，其特征在于，所述突变体DNA聚合酶为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的蛋白质。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸编码如权利要求1所述的突变体DNA聚合酶。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有如权利要求2所述的分离的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求3所述的重组表达载体或基因组中整合有外源的如权利要求2所述的分离的多核苷酸。

5.一种制备如权利要求1所述的突变体DNA聚合酶的方法，包括如下步骤：

在合适的条件下培养如权利要求4所述的宿主细胞，使之表达所述突变体DNA聚合酶。

6.一种如权利要求1所述的突变体DNA聚合酶的纯化方法，包括如下步骤：

(i)将表达目的蛋白的宿主细胞离心，重悬后用溶菌酶进行处理；

(ii)水浴，离心，弃沉淀，收集上清液一；

(iii) 去除上清液一中的核酸和其他杂质，离心，收集上清液二；

(iv) 加入离子交换柱缓冲液，过滤，过离子交换柱，梯度洗脱除杂，收集不同的洗脱峰段，进行蛋白质的分离，得到目的蛋白。

7.如权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法具有以下一个或多个特征：

1) 步骤（i）中的重悬的方法是：使用8-12mmol/L磷酸盐缓冲液进行重悬；

2) 步骤（i）中, 用溶菌酶进行处理时，加入混合液一混合反应，

以混合液一的总体积为基准计，混合液一配方为：

氯化钾 9~11mmol/L；

乙二胺四乙酸 0.5~2 mmol/L；

苯甲基磺酰氟 0.5~2 mmol/L；

丙三醇 体积百分比1%~8%；

吐温-20 体积百分比0.1%~1%；

NP-40 体积百分比0.1%~1%；

溶剂为Tris-HCl缓冲液；

3）以离子交换柱缓冲液的总体积为基准计，步骤（iv）中离子交换柱缓冲液的配方为：

乙二胺四乙酸 0.1~2mmol/L；

苯甲基磺酰氟 0.1~2mmol/L；

丙三醇 体积百分比1%~8%；

吐温-20 体积百分比0.1%~1%；

NP-40 体积百分比0.1%~1%；

溶剂为HEPES缓冲液。

8.一种用于扩增靶核酸的试剂盒，所述试剂盒包含（i）权利要求1所述的突变体DNA聚合酶和（ii）一种或多种选自下组的试剂：缓冲液、金属阳离子、延伸核苷酸、引物、探针、去污剂、染料、荧光分子、抗凝剂和细胞裂解剂。