[发明专利]离体验证柑橘柚类S-RNase自交不亲和功能的方法

说明书

本发明涉及一种离体验证柑橘柚类S‑RNase自交不亲和功能的方法，包括以下步骤：步骤1：获得受体植株的S‑RNase蛋白；步骤2：从供体植株中采集花粉；步骤3：用步骤1中得到的S‑RNase蛋白处理步骤2中得到的花粉，测定所述S‑RNase蛋白的处理对所述花粉萌发花粉管的影响。通过本发明的方法，可采取离体培养的方式快速验证柑橘自交不亲和花柱基因，利用合适浓度的重组蛋白处理恰当的花粉，可引起自交亲和或者不亲和反应，避免了柑橘S基因转基因验证的问题。

技术领域

本发明涉及柑橘种植和育种领域，更特别地，涉及一种离体验证柑橘柚类S-RNase自交不亲和功能的方法。

背景技术

柑橘柚类(Citrus grandis)属于芸香科柑橘属，具有自交不亲和现象。自交不亲和性状在物种的进化过程中具有重要意义，它促进异交，抑制自交，增加群体多样性。从20世纪90年代开始，对于自交不亲和的研究主要集中在十字花科，罂粟科，以及茄科、蔷薇科、玄参科。在这些植物中存在3类不同的自交不亲和机制，每类机制由不同的基因调控自交不亲和反应。其中在植物中分布最为广泛的一种自交不亲和机制，是以茄科为代表的基于S-RNase介导配子体型机制。

最初，人们通过对不同基因型的烟草花柱蛋白进行提取，利用双向电泳技术找到一个与S₂位点紧密连锁的32KDa的糖蛋白，而在S₃S₃植株花柱蛋白中无此蛋白点。McClureand Clarke发现该花柱S糖蛋白与两个真菌中的RNase酶催化域具有同源性。通过高氯酸沉淀方法，从花柱粗蛋白中纯化得到S糖蛋，证明确实具有核糖核酸酶活性，因此命名为S-RNase。之后，在相似的糖蛋白在其他茄科植物中被鉴定，如番茄，土豆，矮牵牛等。在1994年，Leed等人首次通过转基因技术证明了该糖蛋白的功能，他们在基因型为S₂S₃茄科植株中反义抑制S₃-RNase表达，最终使得植株丧失拒绝S₃花粉的能力。

本课题组的研究发现柑橘柚类也属于由S-RNase介导的自交不亲和类型。由于柚类童期较长，难以通过转基因技术进行功能验证，这也是木本植物基因功能研究的一大难题。

发明内容

为解决以上问题，我们开发了一种研究S-RNase对目标植株花粉的花粉管的生长是否具有抑制作用的方法。

基于以上研究，本发明提供了一种离体验证柑橘柚类S-RNase自交不亲和功能的方法，包括以下步骤：

步骤1：获得受体植株的S-RNase蛋白；

步骤2：从供体植株中采集花粉；

步骤3：用步骤1中得到的S-RNase蛋白处理步骤2中得到的花粉，测定所述S-RNase蛋白的处理对所述花粉萌发花粉管的影响。

在一个优选实施方案中，步骤1包括以下步骤：

步骤11：获得所述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列；

步骤12：根据所述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列构建S-RNase蛋白表达系统，表达得到所述S-RNase蛋白。

在一个优选实施方案中，S11中通过对所述受体植株中的S-RNase基因进行测序来得到所述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列。

在一个优选实施方案中，步骤12包括以下步骤：

步骤121：将所述述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列克隆到PGEX-6p-1中，得到S-RNase蛋白表达质粒载体；

步骤122：将所述S-RNase蛋白表达质粒载体转入蛋白表达用的大肠杆菌中，得到S-RNase蛋白表达菌株；