[发明专利]离体验证柑橘柚类S-RNase自交不亲和功能的方法

权利要求书

1.一种离体验证柑橘柚类S-RNase自交不亲和功能的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：获得受体植株的S-RNase蛋白；

步骤2：从供体植株中采集花粉；

步骤3：用步骤1中得到的S-RNase蛋白处理步骤2中得到的花粉，测定所述S-RNase蛋白的处理对所述花粉萌发花粉管的影响。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1包括以下步骤：

步骤11：获得所述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列；

步骤12：根据所述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列构建S-RNase蛋白表达系统，表达得到所述S-RNase蛋白。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，S11中通过对所述受体植株中的S-RNase基因进行测序来得到所述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤12包括以下步骤：

步骤121：将所述述受体植株的S-RNase蛋白的DNA编码序列克隆到PGEX-6p-1中，得到S-RNase蛋白表达质粒载体；

步骤122：将所述S-RNase蛋白表达质粒载体转入蛋白表达用的大肠杆菌中，得到S-RNase蛋白表达菌株；

步骤123：讲所述S-RNase蛋白表达菌株培养至对数期，然后加入IPTG诱导表达，从诱导表达的菌体中提取带GST标签的蛋白即所述S-RNase蛋白。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2包括以下步骤：

步骤21：从所述供体植株收集成熟花药；

步骤22：处理所述花药，使其释放花粉，收集所述花粉。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤22中，通过将所述花药在28℃干燥环境下放置1-2天来使其释放花粉。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤3包括以下步骤：

步骤31：将所述花粉洒在所述花粉液体培养基上培养2h；

步骤32：向步骤31中培养后的花粉培养物中加入所述S-RNase蛋白，继续培养8h；

步骤33：测定培养后的花粉的花粉管长度，根据所述花粉管长度评估供体植株与受体植株之间的自交不亲和性。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述花粉液体培养基包含0.02％MgSO₄，0.01％KNO₃，0.03％Ca(NO₃)₂，0.01％H₃BO₃，15％PEG-4000和20％蔗糖，pH 6.0。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述花粉在28℃黑暗环境中培养。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤32中添加所述S-RNase蛋白的终浓度为7.5μg/mL。