[发明专利]一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒

说明书

本发明提供了一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括SNP位点识别的第一类引物、协助第一类引物进行SNP特征序列恒温扩增的第二类引物和第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶、核酸聚合酶和核酸双链荧光染料的反应混合液，以及使用说明书，反应体系采用引物激活式恒温链置换核酸扩增方式。本发明所述的一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒灵敏度高，可以检测到22aM的目标物，该方法选择性好，有10000倍的错配区分率，反应一步完成且为闭管反应，避免了交叉污染，同时反应所需时间短，无需荧光标记，可以直接检测基因组样品，节省了时间和人力成本。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其是涉及一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒。

背景技术

基因多态性广泛存在于生物体基因组中，其中单碱基多态性(SNP)是最常见的基因多态性形式。SNP主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引起的DNA序列多态性，它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。SNP在人类基因组中广泛存在，是基因突变的一种，主要是碱基置换突变，平均每500-1000个碱基对中就有1个，总数估计可达300万个甚至更多。SNP可提供重要的遗传数据，对于疾病的诊断、法医鉴定分析有极其重要的意义。

目前，国内外现有的SNP检测技术主要有以下几种，基于芯片技术的检测方法、高分辨率融解曲线检测法，Taqman荧光探针法、等位基因特异性扩增法、质谱法和高效液相层析法等，其中等位基因特异性扩增法主要采用PCR扩增的方式，PCR循环扩增的过程中引物链延伸反应容易发生模板与引物之间的碱基错配，导致合成的DNA片段不均一，PCR产物特异性较差。近几年，一系列的基因突变的检测方法层出不穷，同时经典的方法也在不断地被改进，激活式引物恒温链置换核酸扩增反应为聚合酶链式反应的一种特殊型式，在引物存在情况下，1小时内即可完成DNA或RNA的扩增反应，激活式引物恒温链置换核酸扩增反应是一种在等温条件下进行的高效率的核酸放大技术，这种技术只需要一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加之其有较高的灵敏度与专一性，非常适合应用于各种核酸检测。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，以解决SNP位点检测选择性不高、灵敏度低、交叉污染等问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种快速检测SNP位点的荧光定量试剂盒，包括包括SNP位点识别的第一类引物、协助第一类引物进行SNP特征序列恒温扩增的第二类引物和第三类引物、核苷酸单体混合物、核糖核酸内切酶RNase H2、核酸聚合酶Bst DNA和核酸双链荧光染料SYBR Green I的反应混合液，以及使用说明书。

进一步的，试剂盒的反应混合物包含pH值调节剂，使得所述反应混合物的pH值维持在7.5-9.5之间。

进一步的，试剂盒的反应混合物包含多种选择下组的成分：包含Mg²⁺、K⁺、(NH₄)⁺、H⁺、Cl^-、SO^2-、Tris-Cl和细胞表面活性剂。

进一步的，试剂盒包含的引物的设计原则为：第一类引物、第二类引物和第三类引物分别与所述基因组DNA中目标碱基位点前后的一段或两段序列一致或互补，条件是所述的第一类引物3’端序列与基因组DNA在目标碱基位点互补，并且所述的第一类引物中与目标碱基互补的碱基为核糖核苷酸，同时所述的第一类引物在3’端修饰有核酸聚合酶延伸反应阻断基团，所述的第二类引物和第三类引物仅由脱氧核糖核酸组成并且3’端可被核酸聚合酶延伸。

进一步的，试剂盒包含的反应混合液中核糖核酸内切酶RNase H2、核酸聚合酶BstDNA与所述第一类引物、第二类引物和第三类引物可分别至于不同的独立容器中。