[发明专利]一种DNA甲基化程度的定量方法及应用

说明书

本发明提供了一种DNA甲基化程度的定量方法及应用，所述方法包括以下步骤：(1)将亚硫酸盐修饰的DNA加入PCR体系，进行数字PCR；(2)根据DNA的甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数，得到DNA的甲基化程度；其中，步骤(1)所述PCR体系包括Taqman探针，所述Taqman探针包括甲基化Taqman探针或非甲基化Taqman探针。本发明的方法将亚硫酸盐修饰的目的基因分别采用甲基化探针和非甲基化探针进行检测，基于数字PCR准确定量出待检测基因的甲基化拷贝数和非甲基化拷贝数，实现了对目的基因甲基化程度的绝对定量，适用于血液样本中微量ctDNA的检测，灵敏度高、特异性强、精准快捷，有利于在液体活检技术领域中的推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA甲基化程度的定量方法及应用。

背景技术

恶性肿瘤已成为致死率最高的疾病之一，尽管已有多种手段用于肿瘤的治疗，但患者的预后往往与肿瘤的分期相关，晚期肿瘤的预后效果较差。世界卫生组织(WHO)指出：肿瘤的早期诊断与治疗有利于将治愈率提高到80％。然而多数癌症早期无明显症状，发展快且易转移，发现时已是中晚期，临床治疗效果不佳。目前临床应用的早期筛查方法包括血清学肿瘤蛋白标志物检测或影像学监测，但存在灵敏度低或滞后的缺点。目前，临床上还缺乏有效的肿瘤早期检测方法。

循环肿瘤DNA也称为ctDNA，是从肿瘤细胞释放到血液循环系统中的游离DNA片段。ctDNA的浓度与肿瘤的进展高度相关，可以用于肿瘤分期、预后评估和动态监测。ctDNA液体活检是指针对ctDNA进行基因组学、转录组学和表观遗传学等方面的检测，该方法不仅取样简单，还能全面反应肿瘤细胞的基因信息，可用于无创式肿瘤早期筛查、辅助诊断分型、用药指导和预后判定。

DNA分子中CpG位点的甲基化是调节基因表达的重要因素。研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞呈现出基因组甲基化水平低、抑癌基因启动子CpG岛甲基化水平高的趋势。在肿瘤发生的早期，同一类型的肿瘤细胞具有稳定一致的特征性DNA甲基化改变，导致相应的抑癌基因失活，因此血液中游离的甲基化DNA可作为肿瘤早期诊断的标志物。

近年来大量研究表明，在肺癌、结直肠癌和肝癌等多种癌症中，甲基化ctDNA与肿瘤的早期诊断和预后监测密切相关，具有重要的临床价值。一项大型研究从全基因组水平上对肝癌组织和正常血液DNA中的485,000个CpG位点的甲基化水平进行了比较，筛选出差异性显著的位点，对近两千例肝癌和正常人血浆中的ctDNA进行了甲基化PCR扩增和测序，分别筛选出10个和8个位点建立了诊断模型和生存预后模型。该诊断模型在训练组715例肝癌患者和560例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了85.7％和94.3％，在验证组383例肝癌患者和275例正常人中的诊断敏感性和特异性分别达到了83.3％和90.5％，均明显高于肝癌血清标志物AFP。并且，该模型能准确区分肝癌患者和慢性肝炎(HBV/HCV)与脂肪肝患者，显示出甲基化ctDNA检测在肝癌早期诊断中的巨大价值。

传统的甲基化检测方法包括甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸盐处理+测序、联合亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)、焦磷酸测序和荧光定量PCR。其中，基于测序的检测结果往往被作为参考标准，但是ctDNA的片段较短，测序结果的误差较大；内切酶法可以进行甲基化的定性分析，但无法实现定量分析；荧光定量PCR法简单便捷，但对于微量样本，检测结果精确性差，灵敏度低。传统方法的缺陷限制了其在临床中的应用。

与荧光定量PCR不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，具有比传统qPCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性。其中，微滴式数字PCR(ddPCR)可确定单拷贝的待检靶分子的绝对数目，成本低，实用性强。