[发明专利]一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物及方法

说明书

本发明提供了一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。本发明在分析CHO细胞核酸重复序列的基础上，选择了一系列高度重复序列作为定量分析基因，使用Taqman探针法qPCR技术将检测灵敏度大大提高2个数量级(5pg/mL)，且在DNA浓度在5pg～50000ng/mL时有良好的线性范围(R²≥0.99)。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。

背景技术

在现代的生产工艺中，依赖于重组蛋白载体来生产生物制剂已经成为主流技术，CHO细胞作为常用的宿主细胞系用于生产生物制剂，而蛋白产品中含有残留的宿主细胞DNA是潜在的安全隐患，因此蛋白制品中DNA残留的多少是生产所必须严格把控的。

为确保生产的生物制品的质量，美国FDA(Food and Drug Administration)在1997年发布的指导原则中规定，最终产品中宿主细胞DNA残留量不得高于100pg/dose；曾经，对于非肠道给药的最终产品中宿主细胞DNA残留量WHO(World Health Organization)公布的相关标准是不得高于100pg/dose，但1998年这一标准修改为不高于10ng/dose；EU(European Union)，2001年公布的相关标准也是最终产品中宿主细胞DNA残留量不得高于10ng/dose；《中国药典》三部2010年版规定原核表达的生物制品其DNA残留量不高于10ng/dose，真核细胞表达的产品的DNA残留量应不高于100pg/dose。

目前2010版《中国药典》中收录的了检测外源DNA残留量的方法有DNA杂交法和荧光染料法。DNA杂交法需要的条件相对简单，但该方法存在时间长，操作繁琐，稳定性、敏感性、特异性较差等缺点；荧光染料法是利用PicoGreen这种高灵敏度的双链DNA荧光染料对DNA含量进行定量测定。该方法的检验灵敏度可达300pg/mL，但良好的线性范围在DNA 1.25～80ng/mL(R²≥0.99)，同时，该方法缺点为容易受到RNA、ssDNA、dsDNA的干扰。

另一方面，针对生物制品成品中宿主细胞DNA残留量(10-1000pg/mL)往往低于有效的线性范围DNA(1.25～80ng/mL)，所以目前尚存在生物制品成品中DNA残留无法准确定量的问题。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物、探针及方法。本发明在分析CHO细胞核酸重复序列的基础上，选择了一系列高度重复序列作为定量分析基因，使用Taqman探针法qPCR技术将检测灵敏度大大提高2个数量级(5pg/mL)，且在DNA浓度在5pg～50000ng/mL时有良好的线性范围(R ²≥0.99)。

本发明的目的是提供一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列。

本发明的再一目的是提供所述序列的引物。

本发明的再一目的是提供所述引物的探针。

本发明的再一目的是提供一种定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法。

根据本发明的用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列，所述序列包括序列a、序列b、序列c、序列d、序列e、序列f、序列g、序列h、序列i和序列j中的任意一个或多个；所述序列a的序列如SEQ ID NO：1所示，所述序列b的序列如SEQ ID NO：2所示，所述序列c的序列如SEQ ID NO：3所示，所述序列d的序列如SEQ ID NO：4所示，所述序列e的序列如SEQ ID NO：5所示，所述序列f的序列如SEQ ID NO：6所示，所述序列g的序列如SEQ ID NO：7所示，所述序列h的序列如SEQ ID NO：8所示。

其中，SEQ ID NO：1为：