[发明专利]一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的序列、引物及方法

权利要求书

1.一种用于定量分析CHO宿主细胞DNA残留的引物和探针，其特征在于，针对序列d设计得到所述的引物和探针，其中，

所述序列d的序列如SEQ ID NO：4所示，

所述引物的序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示，

所述探针的序列如SEQ ID NO：28所示。

2.一种定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1所述的引物和探针。

3.根据权利要求2所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、处理蛋白样品，得到待测DNA溶液；

B、使用一系列浓度梯度的CHO标准品，进行qPCR扩增，以标准品log10对数值为X轴，qPCR扩增Ct值为Y轴，制备标准曲线，并进行线性回归方程拟合获得线性方程；

C、对步骤A得到的待测DNA溶液进行qPCR扩增，得到待测DNA溶液的qPCR扩增Ct值，进而根据步骤B得到的线性方程得到待测DNA溶液中CHO DNA的含量。

4.根据权利要求3所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，步骤A中，先取蛋白样品，依次加入Proteinase K、ddH₂O和缓冲液，然后进行温育消化，然后依次加入异丙酮、核酸助沉剂和磁珠，进行孵育后收集磁珠，去除上清，然后向磁珠加入洗脱液，孵育后收集磁珠，取上清液，即为待测DNA溶液。

5.根据权利要求3所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，步骤A包括以下流程：

1)取200μL蛋白样品，然后按照1mg蛋白加入10μL Proteinase K的比例加入Proteinase K，加入ddH₂O补足至400μL，加入400μL 2×结合缓冲液；

2)55℃温育消化2h，期间颠倒混匀2-3次以充分消化；

3)加入等体积的异丙醇，1μL核酸助沉剂，10μL磁珠，室温旋转孵育10min；

4)磁力架上收集磁珠，去除上清；

5)加入1mL洗涤液，旋转孵育5min，磁力架上收集磁珠，去除上清；

6)重复步骤4)一次，尽可能去除上清后，开盖晾干；

7)磁珠加入50μL洗脱液，65℃旋转孵育10min；磁力架上收集磁珠，转移上清至新的EP管中，即得到待测DNA溶液。

6.根据权利要求3所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，步骤B中，CHO标准品的浓度梯度依次为：5000pg/10ul、500pg/10ul、50pg/10ul、5pg/10ul、0.5pg/10ul和0.05pg/10ul。

7.根据权利要求3所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，步骤B和步骤C中的qPCR扩增程序为：先在95℃温度下预变性10min；然后进行40个循环，其中每个循环依次进行95℃，15s和60℃，1min。

8.根据权利要求3所述的定量分析CHO宿主细胞DNA残留的方法，其特征在于，步骤B和步骤C中，使用的探针标记为FAM荧光团。