[发明专利]一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法

说明书

本发明属于植物保护领域，提供了一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法。本发明在小麦苗期时对样本进行多重PCR检测，可以同时检测小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦茎基腐病菌，为小麦根茎部病害的早期诊断和有效防治提供技术支持。该PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点，可应用于田间小麦样本根茎部病害的快速检测，具有较高的实际应用价值。

技术领域

本发明属于植物保护领域，具体涉及一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法。

背景技术

小麦是一种重要的粮食作物，在中国的粮食安全和农业现代化发展中都占有重要地位。山东省是中国小麦第二大主产区，种植面积及产量均居全国前列。但是，近年来，小麦根茎部病害的流行，对山东省小麦的品质和产量造成了很大的损失。小麦纹枯病、小麦根腐病和小麦茎基腐病是三种重要的小麦根茎部病害。小麦纹枯病的主要病原是禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）。小麦根腐病的主要病原是麦根腐平脐蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）。小麦茎基腐病的病原是镰孢属（Fusarium spp.）真菌。这些病害的病原菌能在土壤中长期存活，在小麦苗期时即可侵染为害。一旦条件合适，病症容易扩展导致蔓延成灾。这些病害常常混合发生，早期症状相似，不易区分，防治较为困难。因此，建立快速检测技术对于小麦根茎部病害的防治具有重要的指导意义。

分子生物学的发展和 PCR 技术的诞生为植物病原菌的检测、鉴定和量化提供了新的方法和手段。多重PCR(multiplex PCR)是指在同一反应体系中加入两对或两对以上引物，当体系中存在与各引物对特异互补的模板时,就会出现相应的条带。这一概念是Chamberlian于1988年首先提出。多重PCR具有快速、特异、灵敏、低成本等优点，现已被广泛应用于植物病原菌的检测与鉴别。陈思等利用多重PCR技术，在同一体系中对小麦秆锈病、小麦叶锈病和小麦白粉病进行了准确地区分；高士刚等建立了同步检测黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌的多重PCR方法。

目前，虽然已经有相关文献报道过这三种病害（小麦纹枯病、小麦根腐病和小麦茎基腐病）的同时检测，但本发明所采用的引物都是自主设计的，并利用正交设计的方法建立和优化了检测体系，能同时检测以上三种小麦根茎部病害，具有重要的实践意义。

发明内容

本发明提供了一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，利用多重PCR技术可以在小麦苗期实现快速检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种快速检测三种小麦根茎部病害的方法，包括以下步骤：

ST1 取样，田间取苗期植株；

ST2 提取基因组DNA，采用改良的CTAB法提取基因组DNA；

ST3 进行多重 PCR 反应，添加根据禾谷丝核菌rDNA-ITS、麦根腐平脐蠕孢菌rDNA-ITS、镰孢菌（Fusarium spp.）EF-1α基因序列设计的引物各一对，添加Taq DNA聚合酶、dNTP，进行多重 PCR 反应，PCR扩增程序为：预变性 94℃，5 min；94℃变性30s，53.0-63℃时退火30s，72℃延伸 1min，35个循环，72℃延伸 5 min；

ST4 进行DNA电泳并分析。

优选的，步骤ST3所述设计的引物为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6 。

优选的，步骤ST3所述退火30s，温度为55℃。

优选的，步骤ST3中WKF-S18/WKR-S8浓度为0.24-0.48µmol/L。