[发明专利]鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法

说明书

一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：针对鸭坦布苏病毒的E蛋白基因设计了一对引物，上游引物序列如SEQ NO:1所示，下游引物序列如SEQ NO:2所示；引物在DTMUV BYD‑1株的靶序列被人工连接到pUC57载体上，形成标准品重组质粒；分别以标准品重组质粒和待测样品中的核酸为模板，进行qPCR扩增反应；反应后采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值并进行熔解曲线分析，当Ct值≤36且Tm值在82.9~83.3之间时，样品中含有鸭坦布苏病毒，为阳性；建立标准曲线，得待测样品含量。本发明方法可以检测鸭坦布苏病毒分离株以及WF100活疫苗，灵敏性高，特异性好。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法以及引物，该检测方法能够定量检测鸭坦布苏病毒。

背景技术

坦布苏病毒（Tembusu virus，TMUV）是黄病毒属的成员，核酸类型为ssRNA，属于恩塔亚病毒血清群，该病毒会导致鸭的产蛋量大幅下降，并常伴有脑炎和卵巢炎。1955年，在马来西亚吉隆坡的三带喙库蚊体内首次分离到该病毒。此后，从南亚和中国的库蚊和鸭、鹅、鸡、鸽及麻雀等多种禽类中接连分离到该病毒。2000年，在马来西亚的肉鸡中发现该病毒感染，表现为脑炎和生长阻滞。2010年，我国东南沿海蛋鸭大面积爆发TMUV感染，此后在我国大部分产鸭地区，包括北京、江苏、上海、浙江和重庆等地都有鸭产蛋减少症的报道。而且，从2013年起，我国的鸭坦布苏病毒疫情向东南亚的泰国等地蔓延。系统发生分析表明TMUV在禽类中没有物种屏障，包括东南亚和中国两个世系，传播方式暂不明确。

在山东和云南捕获的尖音库蚊和三带喙库蚊中，用病毒分离或RT-PCR检测到TMUV的比例很高。在山东进行的血清学筛查表明有人类感染TMUV，但是未有人类感染发病的报道。在东南亚人群中，该病毒抗体阳性率达50%左右。虽目前尚未报道有临床症状，但对人类仍可能存在很高的风险，需提高警惕。

目前国内已有多家机构建立了鸭坦布苏病毒的血清学或核酸检测方法，其中核酸检测方法有普通PCR、染料法qPCR、探针法qPCR、LAMP及宏基因组学等方法。虽然探针法qPCR可能具有更高的特异性，但是染料法qPCR可以避免因基因突变而可能造成的探针法漏检，因此被广泛应用。

对于鸭坦布苏病毒的核酸检测，通常针对于保守的包膜蛋白（E蛋白）基因，也有部分研究者针对NS2a、NS3和NS5等基因进行引物设计。2013年，刘宗梁等针对DTMUV BYD-1株的E蛋白基因设计一对引物并建立一步法SYBR Green RT-PCR，不与DPV、DHV、DRV、DPVV、EDSV、NDV及AIV交叉，最低可以检测20 copies的体外转录RNA，在鸭的肝和卵巢等疑似病料中DTMUV阳性率为74%。2015年，刘青涛等针对DTMUV的NS2a基因设计一对引物并建立一步法SYBR Green RT-PCR，不与NDV、AIV、DHV、DPV、GPV、EDSV及CSFV交叉，最低可检测10 copies的体外转录RNA，在人工感染鸭泄殖腔拭子中DTMUV阳性率为100%。2016年，提金凤等针对DTMUV SDLC等6株的E蛋白基因设计一对引物并建立SYBR Green PCR，不与AIV、NDV、E.coli和肠炎沙门菌交叉，最低可检测10 copies/μL重组质粒，在人工感染小鼠肝、脾和脑样本中DTMUV阳性率为100%。虽然目前多个机构已建立了DTMUV的PCR方法，但目前仍未见形成商业试剂盒。

发明内容

本发明旨在提供一种鸭坦布苏病毒的qPCR检测方法以及引物，本发明的检测方法具有很高的灵敏性和很好的特异性。