[发明专利]一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用

说明书

本发明涉及一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用，采用全局转录因子定向进化的全新调控策略，利用连续易错PCR技术对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1中，能对细胞内的多个代谢途径和生理系统造成扰动，从而显著改善菌株由多个基因共同调控的复杂表型。本发明获得的四种突变菌株合成多个吩嗪类化合物的能力和接种微生物燃料电池后产生的功率密度比野生型IrrE重组菌株和野生型铜绿假单胞菌株均明显提高。上述突变株的获得对于铜绿假单胞菌在吩嗪类化合物生物合成及其微生物燃料电池领域的应用提供了新的思路和有价值的实验材料。

技术领域

本发明属于蛋白质工程和生物技术领域，涉及铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用。

背景介绍

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在自然界中分布广泛。吩嗪类化合物作为铜绿假单胞菌产生的主要次级代谢产物，具有抑菌谱广泛、毒性低、环境兼容性好等特点，目前该类化合物在生物防治和环境处理领域表现出巨大的应用潜力。例如，吩嗪-1-羧酸(PCA)能够抑制由真菌病原体引起的小麦全蚀病；吩嗪-1-甲酰胺能(PCN)对西红柿枯萎病等病原菌具有显著的抑制作用；1-羟基-吩嗪(1-OH-PHZ)对绿藻和蓝藻的生长具有一定的抑制作用，可应用于海洋的防污工作；绿脓菌素(PYO)具有降解石油烃的功能，可应用于清洁海洋污染。

大量文献证明，铜绿假单胞菌合成吩嗪类化合物的能力除了受到由多个基因组成的生物合成基因簇(phzA1B1C1D1E1F1G1(phzA1)和phzA2B2C2D2E2F2G2(phzA2))的调控之外，还受到胞内一些生理系统(如群体感应系统)和转录因子(如sigma因子)的影响。目前，利用分子生物学技术提高铜绿假单胞菌合成吩嗪类化合物的工作多是以单个基因为对象进行操作(如敲除或表达)，操作后提高的目标产物的种类也比较单一。

铜绿假单胞菌还是一种重要的模式产电微生物，将其接种微生物燃料电池后，能够将储存在有机物(包括废水中的有机污染物)中的化学能直接转化为电能。该系统与传统的燃料电池相比，具有能量转化率高、燃料来源多样、反应条件温和、经济和无污染等优点。产电微生物作为微生物燃料电池阳极的催化剂，是影响系统电能输出的关键因素。越来越多的研究表明，微生物的产电性能是非常复杂的表型，受到胞内多个生理过程(如生物膜形成)、代谢途径(中介体合成)和转录调控系统(如群体感应系统)的影响。目前，研究者多是以单个或多个产电相关的功能基因为对象进行操作(如敲除或表达)，在提高效果上存在一定的局限性。

IrrE是来源于极端微生物—耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)的转录因子，研究者发现，该转录因子在宿主细胞中发挥着全局调控作用，这暗示着它在改善受到多个基因调控的复杂表型方面表现出良好的应用潜力。目前，研究者将其进行异源表达已成功提高了一些模式微生物的环境压力耐受性，如大肠杆菌(Escherichia coli)对辐射、渗透压、热、盐和氧化压力的耐受性；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)对乙醇和酸的耐受性；

定向进化属于蛋白质的非理性设计，不需要事先了解蛋白质的结构、催化机制、保守序列等因素，而是通过模拟自然进化机制为蛋白编码基因创造体外进化的条件，进而对目的蛋白进行分子改造。易错PCR技术是目前应用最广泛的定向进化方法之一，具有操作方便、快速、高效的优点。本发明采用全局转录因子定向进化的全新调控策略，利用连续易错PCR技术对来源于耐辐射异常球菌中的全局转录因子IrrE进行突变，筛选得到的突变体导入铜绿假单胞菌PAO1(美国典型培养物保藏中心ATCC15692)中，能对细胞内的多个代谢途径和生理系统造成扰动，显著提高菌株同时合成多个吩嗪类化合物的能力以及产电性能。

发明内容

本发明的目的是提供一种同时合成多个吩嗪类化合物的能力以及产电性能的铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法及其菌株和用途。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现。