[发明专利]一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其应用

说明书

本发明涉及一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，其包括全长Bst DNA聚合酶，并包括嵌入式荧光染料；本发明还涉及一种含有上述等温核酸扩增体系的试剂盒及其在在儿童腹泻病原体检测中的应用，该应用中扩增引物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示、如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示、如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示的分别用于检测A群轮状病毒、星状病毒、腺病毒的引物组。全长Bst DNA聚合酶具有5'‑3'双链特异性外切酶活性及聚合活性，这一特点被应用于本发明所述的Exo‑NAT方法，并通过向反应体系中加入嵌入式荧光染料配合熔解曲线分析，可实现高特异性、高灵敏性的多重核酸检测，并成功应用于儿童腹泻病原体的精准检测，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，以及含有该等温核酸扩增体系的试剂盒及其应用。

背景技术

儿童感染性腹泻是一类临床多发病和常见病，严重威胁着儿童的生命健康，常年居于造成儿童病死率的前三位，且在发展中国家该疾病的情况更为严重。造成儿童感染性腹泻的病原体类型十分繁多，其中A群轮状病毒，星状病毒及腺病毒是造成感染的常见病原体，目前用于诊断这些病毒的方法主要包括免疫学方法及以PCR为基础的核酸检测方法，这些方法常常需要繁琐的操作程序、较为昂贵的仪器设备，专业的技术人员以及易出现假阳性或假阴性结果。

为了克服上述缺点，目前开发了适用于床旁快速检测的方法，一大类等温核酸扩增方法相继出现。如环介导的等温扩增(LAMP)，解旋酶依赖的等温扩增(HDA)，重组聚合酶扩增(RPA)等。这些等温扩增方法具有很多明显优势，如仪器设备及人员要求低，操作方便，设备易于简化，床旁使用等。但是这些等温核酸扩增的方法，由于其引物构成复杂，浓度较高且缺乏统一的退火温度，常常导致严重的假阳性现象，限制了其临床实际应用。因此，开发新的高特异性的等温核酸扩增方法具有重要的临床需求和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其试剂盒和应用，本发明利用全长Bst DNA聚合酶开发出了一种具有高特异性的等温核酸扩增方法(Exo-NAT，Exo-Nuclecic Acid Testing)，并将其应用于常见儿童腹泻病原体的检测。本发明将全长Bst DNA聚合酶应用于Exo-NAT方法，通过向反应体系中加入嵌入式荧光染料配合熔解曲线分析，保证了该体系及方法的高度特异性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，其包括全长Bst DNA聚合酶，所述全长Bst DNA聚合酶具有5'-3'双链特异性外切酶活性及聚合活性。

为了进一步优化上述等温核酸扩增体系，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述等温核酸扩增体系还包括荧光染料，所述荧光染料选自SYBRGreen、Ever Green、Pico Green或SYTO系列。优选地，所述荧光染料为SYTO系列，更优选为SYTO-9。

进一步地，所述等温核酸扩增体系还包括Tris-HCl(pH 8.8@25℃)，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，Tween-20，dNTPs，扩增引物；其中，所述扩增引物包括前向外引物(FOP)，反向外引物(ROP)，前向内引物(FIP)及反向内引物(RIP)。