[发明专利]一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其应用

权利要求书

1.一种等温核酸扩增体系在儿童腹泻病原体检测中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断的应用；所述等温核酸扩增体系包括全长Bst DNA聚合酶，所述全长Bst DNA聚合酶具有5'- 3'双链特异性外切酶活性及聚合活性；

所述等温核酸扩增体系还包括荧光染料，所述荧光染料选自SYBR Green、Ever Green、Pico Green或SYTO系列；

所述等温核酸扩增体系还包括Tris-HCl，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，Tween-20，dNTPs，扩增引物；其中，所述扩增引物包括FOP、ROP、FIP、RIP；

引物FIP和引物RIP标记荧光基团和淬灭基团；其中所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、Texas Red、JOE、TFAM；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB；

所述等温核酸扩增体系在使用时采用的方法为Exo-NAT，所述Exo-NAT方法的原理为：在65℃的反应条件下，靶序列的双链呈松散的状态，内引物可以与靶序列配对，延伸后，在一侧可形成茎环结构，反向内引物继而配对延伸，当遇到之前形成茎环结构的双链部分时，外切酶活性可以起作用，将这一部分双链剪切掉，反向亦是相同机理，最终可形成产物1；同时两对外引物，也可同时与靶序上的互补区域结合延伸，最终形成产物2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述儿童腹泻病原体包括A群轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒，所述扩增引物包括用于检测A群轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒的引物；其中，所述用于检测A群轮状病毒的引物包括如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；所述用于检测星状病毒的引物包括如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；所述用于检测腺病毒的引物包括如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述等温扩增体系中各组分的浓度如下：20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，10 mM (NH₄)₂SO₄，8mM MgSO₄，0.1% Tween-20，0.2μΜ FOP/BOP，1.6μΜ FIP/RIP，5U 全长Bst DNA聚合酶，dNTPs，1× SYTO-9。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述等温扩增体系的扩增条件为62~68℃，60~120mins。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，所述儿童腹泻病原体检测为单重检测或多重检测，其最低检测限为100拷贝/反应。