[发明专利]基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法

说明书

本发明提供了一种缺失突变基因的荧光检测试剂盒，所述试剂盒包括：PNA捕获探针；DNA探针；锁式探针；DNA聚合酶；DNA连接酶；滚环扩增引物；荧光探针。本发明还提供了使用所述的试剂盒进行缺失突变基因荧光检测的方法，所述方法包括以下步骤：1)将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；2)使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；3)使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；4)使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。

技术领域

本申请涉及一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法，属于化学和生物传感技术领域。

背景技术

基因序列缺失突变是由于DNA分子中发生碱基对的缺失引起的基因结构改变，是基因突变中的一种，人体中的基因缺失往往诱发多种疾病，如表皮生长因子(EGFR)的18-21号外显子发生基因缺失，诱发肺癌尤其是非小细胞肺癌的产生。伴随着疾病的发生发展，人体病变组织或者血液中缺失突变基因成为临床疾病快速、精确诊断的重要生理指标。目前，qRT-PCR(定量逆转录聚合酶链式反应)和第二代基因测序技术是针对缺失突变基因主要的检测方法。qRT-PCR技术可以实现几个DNA分子的扩增，具有很高的灵敏度和专一性，然而主要缺陷在于反应过程需要精确控温，实验条件要求较高，不适合现场使用；第二代基因测序技术需要专业且昂贵的设备进行数据采集和解析，从而限制其广泛应用。

滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA)是现阶段应用最广泛的恒温扩增技术之一，以环形DNA为模板，以寡聚核苷酸(与部分环状模板互补)为引物，在有链置换作用的DNA聚合酶(如phi 29DNA polymerase)作用下，引物延伸一个循环至起始延伸处置换下旧的DNA链而继续进行下一个循环，如此多次循环，生成含有大量重复序列的DNA长链。滚环扩增凭借其高特异性、高灵敏度和易操作等性质被大量应用于免疫芯片检测、细胞原位检测、全基因组DNA检测、单核苷酸多态性检测等多种领域中。

本发明结合滚环扩增技术、氧化石墨烯荧光淬灭技术和荧光检测法，设计一个针对缺失突变基因的检测体系，其检测限达到1pM，与其他检测缺失突变基因的检测方法相比，具有高灵敏度、高特异性、操作简便、快速的特点。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种缺失突变基因的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针。

优选地，所述PNA捕获探针是与靶基因缺失突变位点附近靠近3’端的10至25个碱基序列完全互补的PNA序列，所述PNA序列的羧基端与靶基因5’端碱基互补，所述PNA序列的氨基端与靶基因3’端碱基互补。

在本发明的一个优选实施方式中，所述的PNA捕获探针羧基端(CONH₂)连接1-5个聚乙二醇单甲醚(mPEG)单体以增加水溶性。

优选地，所述DNA探针是与靶基因缺失突变位点两端部分序列完全互补的DNA序列；其中，所述DNA探针与靶基因杂交时，与靶基因缺失突变位点处对应的部分是以单链形式存在的单链区。

本发明中的DNA探针与正常基因杂交形成完全互补的DNA双链，而与缺失突变基因杂交时，DNA探针中间部分不结合，以单链形式存在。

优选地，所述锁式探针的5’端和3’端与所述DNA探针的单链区完全互补，所述锁式探针的5’端和3’端的与所述DNA探针单链区的连接点位于所述DNA探针单链区的中心。

优选地，所述DNA聚合酶和所述滚环扩增引物能够对由所述锁式探针和所述DNA探针单链区组成的环状DNA进行滚环扩增。

所述锁式探针和所述DNA探针单链区在DNA连接酶的作用下能够形成环状的DNA，以进行后续的滚环扩增。