[发明专利]基因缺失突变的荧光检测试剂盒和荧光检测方法

权利要求书

1.一种基因缺失突变的荧光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：PNA捕获探针、DNA探针、锁式探针、DNA连接酶、DNA聚合酶、滚环扩增引物和荧光探针；

所述DNA探针是与靶基因缺失突变位点两端部分序列完全互补的DNA序列；其中，所述DNA探针与靶基因杂交时，与靶基因缺失突变位点处对应的部分是以单链形式存在的单链区；

所述PNA捕获探针的序列为：H2NOC-CTACACTCAAA-(mPEG)3-NH2；

所述DNA探针的序列为：

5’-TCCTTGTTGGCTTTCGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCTTGATAGCGACGGGAA-3’；

所述锁式探针的序列为：

5’-P-AAGCAACATCTCAACTATCATAAGACTCGTCATGTCTCAGCAGCTTCTAACGGTCACTAATACGACTCACTATAGGTTCTGGAAAGCGGAATTAAGAG-3’；

所述滚环扩增引物的序列为：

5’-GCTGAGACATGACGAGTC-3’；

所述荧光探针的序列为：

Cy5-CTAACGGTCACTAATACG-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PNA捕获探针是与靶基因缺失突变位点附近靠近3’端的10至25个碱基序列完全互补的PNA序列，所述PNA序列的羧基端与靶基因5’端碱基互补，所述PNA序列的氨基端与靶基因3’端碱基互补。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述锁式探针的5’端和3’端与所述DNA探针的单链区完全互补，所述锁式探针的5’端和3’端的与所述DNA探针单链区的连接点位于所述DNA探针单链区的中心。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶和所述滚环扩增引物能够对由所述锁式探针形成的环状DNA进行滚环扩增。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针是带有荧光标记的DNA信号探针，所述荧光探针能够与环状DNA滚环扩增产物的重复片段序列结合。

6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA连接酶选自E·coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶中的至少一种；

所述DNA聚合酶选自phi29 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、DNA 聚合酶I中的至少一种。

7.使用权利要求1-6中任意一项所述的试剂盒进行非诊断治疗目的的基因缺失突变荧光检测的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1）将所述PNA捕获探针固定在孔板底部，后在缓冲液条件下与靶基因杂交；

2）使被固定在孔板底部的靶基因与DNA探针杂交；

3）使与靶基因杂交后的DNA探针上的单链部分与锁式探针杂交，并使用连接酶进行环化，在滚环扩增引物和DNA聚合酶的作用下进行滚环扩增；

4）使荧光探针与滚环扩增产物杂交，淬灭背景荧光后检测荧光强度的变化。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1）中固定PNA捕获探针的方法包括，向孔板加入PNA探针和固定液，室温震荡孵育1.5-2.5小时，加入屏蔽液，继续震荡孵育20-40分钟，用缓冲液清洗后加入PBS密封保存备用。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述固定液选自碳酸氢钠固定液、碳酸钠固定液、碳酸氢钾固定液、碳酸钾固定液中的至少一种，所述屏蔽液选自赖氨酸屏蔽液、精氨酸屏蔽液、天冬酰胺屏蔽液、谷氨酰胺屏蔽液中的至少一种。

10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤1）中，PNA捕获探针与靶基因杂交的方法包括，加入阻断液后在室温下震荡孵育20-40分钟，使用缓冲液清洗后加入不同浓度的靶基因，继续震荡孵育后使用缓冲液清洗。