[发明专利]一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。本发明建立了以金属钌配合物做为荧光染料进行实时荧光定量PCR的检测方法，结果显示，金属钌配合物做为荧光染料可在一个较宽浓度范围内使用，并可生成熔解曲线进行特异性扩增验证以及多重PCR检测，同时具有灵敏度高、线性范围宽、成本低等优点，可进行大面积推广及应用。

技术领域

本发明涉及一种PCR检测方法及其应用，特别涉及将金属钌配合物应用于核酸扩增检测体系中，如用于实时荧光定量PCR(qPCR)的检测方法。

背景技术

核酸扩增检测对环境检测以及食品质量与安全等领域具有十分重要的意义。聚合酶链式反应(PCR)通过体外扩增产生大量特定核酸序列，已经广泛应用于分子生物学检测中。传统聚合酶链式反应常需要电泳来进行扩增产物验证，费时费力，无法定量起始模板浓度，且容易造成扩增子污染。为克服电泳法终点检测的缺点，开发了实时荧光定量PCR技术，每轮PCR循环产生相应的荧光信号，再通过分析已知标准品的循环阈值获得标准曲线，可对未知样品中核酸浓度实现精确计算。

实时荧光定量PCR主要分为DNA结合染料法和探针法，探针法具有较强的特异性，不需PCR后处理，但需要根据特定序列合成探针，成本相对较高；荧光DNA结合染料在溶液中几乎不发荧光，当结合到DNA上时发强荧光，并与PCR产生的DNA总量成正比。DNA结合染料以一种非序列特异性结合到DNA双链上，因此不需要根据特定序列合成探针，成本相对较低，但是非特异性扩增产物同样也会产生荧光信号，需要通过测量扩增产物的熔解曲线鉴别PCR扩增产物的特异性。

目前在实时荧光定量PCR中常用的较成熟的染料如SYBR Green I和Eva Green是成本较高的进口商品化试剂。且应用最广泛的SYBR Green I在扩增的过程中存在对反应产生较大的抑制以及信噪比较低等问题，在应用中还发现SYBR Green I在高温以及光源激发时存在稳定性较差的现象。所以，有必要开发经济环保、光稳定性好、实用性强的新型荧光染料应用于核酸检测和便携试剂盒中。

有报道将金属钌配合物核酸分子“光开关”，例如钌多吡啶配合物([Ru(phen)₂(dppz)]²⁺、[Ru(bpy)₂(dppz)]²⁺，dppz＝dipyrido[3,2-a:2’,3’-c]phenazine,bpy＝2,2’-bipyridine,phen＝1,10-phenanthroline)应用于核酸检测，并且也具有一些优于其它有机结合染料的性质，例如荧光背景低、水溶性强、斯托克斯(stokes)位移大等优点(详见参考文献：J.Am.Chem.Soc.1990,112,4960；Microchemical Journal 1999,63,356；Microchimica Acta 2000,134,57；Analytica Chimica Acta 2000,403,209；AnalyticaChimica Acta 2001,436,207；Dalton Transactions 2016,45,13261)。还有研究表明，钌金属配合物可以用于凝胶电泳分析PCR扩增产物的荧光染料(Method Enzymol.1993,226,576)。但是，在实时PCR分析领域目前尚未见到其应用的研究和报道，原因包括：1)目前金属钌配合物的研究主要集中在生物无机化学领域，而PCR反应体系具有自身特点，进行实时PCR扩增研究还需要有分子生物学的背景，属于交叉学科研究领域；2)由于金属钌配合物特殊的荧光性质，并不是市面上所有的实时PCR仪都能够高灵敏的检测出它们的荧光信号，硬件上的要求在一定程度上限制了研究人员在PCR分析领域对金属钌配合物的应用展开研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

本发明的一个目的在于提供一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：