[发明专利]一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：该实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：

以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分；以拷贝数不同的多个核酸样品作为标准品，将各标准品分别作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按预设的反应程序分别进行实时荧光定量PCR，反应结束后根据各标准品的循环阈值绘制标准曲线，线性浓度范围达1×10²copies/μL模板浓度；以未知拷贝数的核酸样品作为所述实时荧光定量PCR反应体系中的扩增模板组分，按所述反应程序进行实时荧光定量PCR，根据所述标准曲线以及未知拷贝数的核酸样品的循环阈值计算该样品的DNA拷贝数；

所述金属钌配合物为[Ru(phen)₂(dppz)]²⁺或[Ru(bpy)₂(dppz)]²⁺；

所述金属钌配合物在反应体系中的终浓度为4-10μM；

实时荧光定量PCR采用三步法PCR反应程序，延伸阶段利用一定的通道收集荧光信号：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500 nm和550-750 nm，共30个循环；68℃再延伸5min，根据该信号获得所述标准品或未知拷贝数的核酸样品的循环阈值。

2.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述核酸样品为DNA或由提取的RNA反转录而成的DNA。

3.根据权利要求1所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：

1）设计引物

根据检测目的及样品的不同选取靶序列并设计引物；

2）配制反应体系，反应体系包括热稳定DNA聚合酶、引物、dNTP、模板DNA以及所述金属钌配合物；

3）实时荧光定量PCR

根据靶序列及引物的不同，确定扩增程序；以已知初始浓度的DNA样品为模板，对模板进行预变性后按扩增程序循环反应并在循环反应的延伸步骤进行荧光信号收集，荧光信号的收集通道为：激发波长为400-500 nm，发射波长为550-750 nm；循环反应结束后再次进行延伸；然后根据收集的信号建立扩增曲线，由扩增曲线确定该DNA样品的循环阈值；

4）重复步骤3），得到不同初始浓度的DNA样品各自的循环阈值，结合对应DNA样品的浓度建立标准曲线；

5）按照步骤3）对未知初始浓度的DNA样品进行扩增，获得相应的循环阈值并带入步骤4）获得的标准曲线中，从而计算得到该DNA样品的初始浓度。

4.根据权利要求3所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述未知初始浓度的DNA样品利用试剂盒提取并纯化得到。

5.根据权利要求1或3所述一种基于金属钌配合物的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述反应体系的终体积为10-20μL。

6.一种金属钌配合物在实时荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于：以金属钌配合物作为实时荧光定量PCR反应体系中的染料组分，所述金属钌配合物在反应体系中的终浓度为4-10μM；所述金属钌配合物为[Ru(phen)₂(dppz)]²⁺或[Ru(bpy)₂(dppz)]²⁺；

实时荧光定量PCR采用三步法PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s并采集荧光信号，信号通道的激发和发射波长范围分别为400-500 nm和550-750 nm，共30个循环；68℃再延伸5min。