[发明专利]一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺

说明书

本发明公开了一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺，属于基因工程以及发酵工程技术领域。本发明以Humicola isnolens来源的角质酶基因为目的基因，pET‑20b(+)为表达载体，E.coli BL21(DE3)为表达载体，成功构建了可高效活性表达角质酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET‑20b(+)/hic；同时，本发明创造性地以重组大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET‑20b(+)/hic为生产菌株，采用两阶段温度控制工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵工艺、高诱导菌体浓度结合高诱导强度的诱导控制工艺相结合的生产工艺以生产角质酶，具有产量高，原料来源广泛，生产成本较低等优势。

技术领域

本发明涉及一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌及其发酵工艺，属于基因工程以及发酵工程技术领域。

背景技术

角质酶是一种多功能水解酶，可用于水解短链或长链脂肪酸酯和甘油三酯，也可用于降解植物的多聚体角质。

相较于脂肪酶，角质酶无盖子结构，更易于降解聚酯，因此，角质酶在农产品深加工、护理用品行业、纺织工业等方面都得到了广泛的应用，尤其在棉织物的生物精炼和人造纤维的表面改性中，角质酶有望替代传统的化学碱处理，对环境保护有重要意义。

角质酶有多种来源，其中，特异腐质霉(Humicola insolens)来源的角质酶热稳定性好，应用于棉织物精炼中时无需预处理，可有效简化工艺流程；但在实际使用中，由于此来源的角质酶在菌中的产量低下以及现有发酵工艺的制约，以此来源的角质酶进行发酵生产的成本太高，这一缺陷大大限制了其工业大规模应用。

目前，常采用构建基因工程菌(Pichia pastori、Escherichia coli、Fusariumvenenatum等)和优化发酵工艺(培养基和诱导条件等)等方法提升角质酶产量，这些方法也取得了一定效果。

但是，从基因工程菌的角度来说，已有的将特异腐质霉(Humicola insolens)来源的角质酶在菌中异源表达得到的基因工程菌，其角质酶产量并未有显著提高，其产出的角质酶活性也十分低下；从发酵工艺的角度来说，现在也缺乏针对角质酶自身功能特性进行发酵工艺特异性优化的策略。

因此，虽然H.insolens角质酶在工业生产中有光明的应用前景，但如何提高其产量，如何对其发酵工艺进行优化，仍需进一步研究。

发明内容

为解决上述问题，本发明以特异腐质霉(Humicola insolens)来源的角质酶基因为目的基因，pET-20b(+)为表达载体，E.coli BL21(DE3)为表达宿主，成功构建了可表达角质酶的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)/hic；同时，本发明创造性地以重组大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-20b(+)/hic为生产菌株，采用两阶段温度控制工艺、恒定溶氧控制工艺、pH控制工艺、补料分批发酵工艺、高诱导菌体浓度结合高诱导强度的诱导控制工艺相结合的生产工艺以生产角质酶，具有产量高，原料来源广泛，生产成本较低等优势。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种高产角质酶的重组大肠杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为角质酶基因；所述表达载体为pET-20b(+)；所述表达宿主为E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述角质酶基因来源于特异腐质霉(Humicolainsolens)。

在本发明的一种实施方式中，所述角质酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒是通过将角质酶基因插入表达载体pET-20b(+)的信号肽序列下游构建而成的。