[发明专利]检测人WT1融合基因的试剂盒及其使用方法

说明书

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人WT1融合基因的试剂盒。本申请试剂盒采用一步法逆转录，即先采用特异性引物与酶将样本中的mRNA逆转录成cDNA，逆转录后的cDNA直接进入下游的荧光定量PCR，对临床外周血标本中的WT1基因的RNA进行定量检测，从而辅助白血病临床诊断并指导相关白血病患者对临床药物的选择，具有高特异性、高准确性和最低检出量的技术优势。

技术领域

本申请涉及融合基因检测领域，具体讲，涉及一种检测人WT1融合基因的试剂盒及其使用方法。

背景技术

白血病是造血系统的恶性肿瘤，其特征是骨髓、淋巴结等造血系统中一种或多种血细胞发生恶性增殖，并浸润体内各组织脏器，导致正常造血组织细胞受抑制，产生各种症状。白血病临床上常以发热、出血、贫血，肝、脾、淋巴结肿大为特点。

近年临床研究表明，约50％的白血病存在某些染色体畸变，如易位、缺失、插入等。染色体易位畸变时大部分情况下形成相关的融合基因，通过对这些融合基因的检测和监测，有利于治疗方案的确定和监测白血病微小残留病灶。然而，还有约50％的白血病没有特定的融合基因，因此将WT1基因作为广谱标志物用于白血病微小残留病灶的检测正得到越来越多学者的认同。WT1基因在多种白血病细胞中高表达，且随着病情的进展表达增高，对白血病预后及再复发有提示和预警作用。

WT1基因(Wilms tumor gene)是从Wilms瘤细胞分离出来的肿瘤基因。该基因主要在胚胎发生过程中表达。在成人则仅肾脏、卵巢、子宫内膜、睾丸、脾脏和正常的造血祖细胞有少量表达。该基因在血液系统中表达具有时间阶段性,在早期造血细胞的分化中起重要作用。

WT1基因在初发急性白血病患者骨髓/外周血中高度表达，在正常骨髓中少量表达，在正常外周血中极低度表达，甚至检测不到。在绝大多数急性髓细胞白血病亚型中均可发现WT1基因呈较高水平表达，大约70.0％的急性髓细胞白血病初诊患者有WT1-mRNA高表达。慢粒患者随着病情从慢性期进展到急性期，WT1基因表达水平逐渐增高。国外学者报道急性淋巴细胞白血病中WT1基因表达阳性率在47.0％～80.0％，并发现急性淋巴细胞白血病中的WT1基因表达低于急性髓细胞白血病。

目前认为WT1基因与白血病的病程转归关系密切：(1)治疗前WT1基因高表达，诱导化疗后WT1基因转阴，停止治疗时尽管原始细胞<5％，WT1基因表达亦升高；(2)WT1基因持续高表达者缓解期较短，随即复发；(3)持续完全缓解者WT1基因水平很低或检测不到；(4)WT1基因持续高水平或降至正常后有急剧升高，大于10^-2预示有复发可能；(5)持续低水平表达者不易复发。

WT1基因在各种类型白血病中表达均增高，测定WT1基因来检测残留白血病法可用于几乎所有类型的白血病，WT1基因表达的定量检测可评价化疗或骨髓移植的疗效和确定白血病细胞的残留量，对早期预测复发及判定预后有重要的临床意义。

白血病残留病灶(MRD)，是指在白血病患者经诱导化疗达到完全缓解后(包括骨髓移植后)，在体内残存少量白血病细胞的状态，需应用更敏感方法才能够检测出白血病细胞。

目前检测MRD的方法多种多样,有形态学方法、细胞培养法、单克隆抗体法、代谢酶测定、细胞遗传学方法、分子生物学方法等,以上方法的精确度、敏感度及特异度均各不相同。近来发展较快且应用较多的为分子生物学方法：荧光原位杂交(fluorescence in situhybridization，FISH)、流式细胞术(flow cytometry，FCM)、聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)，三者在MRD的检测中均占有重要地位。