[发明专利]检测人WT1融合基因的试剂盒及其使用方法

权利要求书

1.一种检测人WT1融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂包括WT1PCR反应液、内参PCR反应液和混合酶液；

其中，所述WT1PCR反应液中含有用于检测WT1融合基因的引物和探针，所述内参PCR反应液含有用于检测内参基因的引物和探针，所述混合酶液中含有Taq酶、UNG酶、RT酶和Rnasin；

所述用于检测WT1融合基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQID NO:2所示的下游引物由SEQ ID NO:3所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；

所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:4所示的上游引物、由SEQ IDNO:5所示的下游引物、由SEQ ID NO:6所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA，SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括对照品，所述对照品包括阴性对照和阳性对照，所述阴性对照为工艺用水，所述阳性对照中含有K562细胞株裂解物。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括参考品，所述参考品用于对目的基因和内参基因进行定量，所述参考品包括：

其中，WT1质粒DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，内参质粒DNA的核苷酸序列如SEQID NO:8所示。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒所适用的样本选自外周血标本。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述混合酶液中含有Taq酶0.6～0.9体积份，UNG酶0.1～0.3体积份，RT酶0.25～0.45体积份，Rnasin 0.2～0.3体积份；所述对照酶液中含有Taq酶0.6～0.9体积份，UNG酶0.1～0.3体积份；

优选的，所述混合酶液中含有Taq酶0.8体积份，UNG酶0.2体积份，RT酶0.375体积份，Rnasin 0.25体积份；所述对照酶液中含有Taq酶0.8体积份，UNG酶0.2体积份；

其中，UNG酶的活性单位为1U/μl，Taq酶的活性单位为5U/μl，RT酶的活性单位为200U/μl。

7.一种检测人WT1融合基因的引物和探针，其特征在于，所述用于检测WT1融合基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的上游引物、由SEQ ID NO:2所示的下游引物、由SEQID NO:3所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团；

优选的，还包括用于检测内参基因的引物和探针，所述用于检测内参基因的引物和探针包括由SEQ ID NO:4所示的上游引物、由SEQ ID NO:5所示的下游引物、由SEQ ID NO:6所示的探针，所述探针的两端标记有荧光基团。

8.根据权利要求7所述的引物和探针，其特征在于，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA；SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有TAMRA。

9.一种如权利要求1～8任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

(1)样本处理：提取RNA，得到样本；

(2)扩增试剂配制：

将WT1PCR反应液与混合酶液混合，得到WT1PCR预混液；将内参PCR反应液与混合酶液混合，得到内参PCR预混液；

(3)加样：从样本、阴性对照、阳性对照、WT1参考品1～WT1参考品4、内参参考品1～内参参考品4中分别取样，分别加入到各PCR预混液中和各内参PCR预混液中；

(4)PCR扩增；

(5)检测。