[发明专利]人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒

说明书

本发明涉及一种人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒，属于分子生物学领域。本发明引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；本发明探针包括针对人EGFR基因T790M位点的突变型探针和野生型探针，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述突变型探针和野生型探针的5’端标记有不同的荧光报告基团，3’端均标记有非荧光淬灭基团并连接有MGB修饰基团；所述突变型探针和野生型探针的至少一个碱基还进行锁核酸修饰。本发明引物扩增特异性和灵敏度度均较高；本发明探针为LNA修饰的TaqMan MGB探针，MGB可以将探针的Tm值提高10℃左右，且LNA修饰探针，提高了PCR反应中DNA分子的稳定性和亲和力，增加特异性和灵敏度。

技术领域

本发明涉及一种人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒，属于分子生物学领域。

背景技术

肺癌是各种肺部恶性肿瘤的统称，分为两类小细胞肺癌(small cell lungcarcinoma,SCLC)和非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma,NSCLC)，非小细胞肺癌约占所有肺癌病例的80％以上，包括两大类：1)非鳞癌(包括腺癌、大细胞癌及其他亚型)；2)鳞状细胞(表皮样)癌。肺癌是世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，位居我国城市人口恶性肿瘤死亡原因之首。

恶性肿瘤的治疗包括化学治疗和靶向治疗，传统的肿瘤化学治疗存在治疗靶向不明确，选择性不强和易产生耐药等特点，导致在其有效率低和在杀伤肿瘤细胞的同时损害正常组织细胞等缺点。靶向治疗是指抗肿瘤药物靶向性地与肿瘤的不同特性靶标位点发生作用而杀死肿瘤细胞,靶向治疗对正常组织影响较小。近年来，肿瘤治疗策略产生革命性的变化即肿瘤的个体化治疗。肿瘤个体化治疗是根据每个个体肿瘤生物学特征以及基因组学和转录组学上的差异进行针对性的治疗，使疗效最大化和毒性最低化。目前靶向治疗无疑是肺癌有效且毒性较低的治疗手段。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种跨膜酪氨酸激酶受体，该受体激酶域激活与癌细胞增殖、转移和凋亡等多种信号传导通路有关。肺腺癌患者EGFR基因敏感突变亚裔人群阳性率要高于高加索人群。EGFR突变主要发生在胞内酪氨酸激酶(TK)区域的前四个外显子上(18～21)，目前发现的TK区域突变有30多种。一代的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosinekinase inhibitors,EGFR-TKIs)吉非替尼、厄洛替尼、埃可替尼，二代的阿法替尼，对于EGFR基因敏感突变的晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者，在无进展生存(progressionfree survival,PFS)、有效率方面，与传统化疗相比均有明显延长，同时患者生存质量及耐受性较好。然而，通常在靶向治疗后，患者会不可避免的出现获得性耐药。

其中，以20号外显子上的T790M突变最为常见。针对EGFR基因T790M突变的定量检测可更精准指导临床，T790M的突变丰度与EGFR-TKI治疗与预后有关，因此EGFR基因T790M突变检测已成为NSCLC患者明确耐药机制和调整治疗方案必须参考的重要指标。

目前基因突变的检测技术主要有sanger测序、高通量测序、ARMS-PCR检测、数字PCR检测。sanger测序、高通量测序、ARMS-PCR检测这三种技术均为定性检测，灵敏度比较差。数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，这种检测方式具有更高的灵敏度和特异性、准确性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种特异性和灵敏度均较高的人EGFR基因T790M位点检测的引物、探针、PCR反应液和试剂盒。