[发明专利]一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，该方法利用柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因(OMP)在不同柑橘黄龙病菌中高度保守性原理,设计两对特异性引物F3/B3和F1/B1，应用这两对引物对待测样品进行PCR扩增,扩增产物经克隆测序获得长度为447bp的基因片段，经NCBI在线比对该片段能100％覆盖柑橘黄龙病菌外膜蛋白合成酶基因，且一致性为100%。本发明检测方法所使用的这对引物有别于其它检测技术，可以用于快速精准鉴定柑橘黄龙病。

技术领域

本发明涉及一种普通柑橘黄龙病菌的检测方法，尤指检测柑橘黄龙病菌亚洲种的巢式PCR的检测方法。

背景技术

柑橘黄龙病是一种发生在柑橘韧皮部，对柑橘产业造成毁灭性伤害的世界性柑橘病害，该病一旦发病无药可治，所以被称之为“柑橘癌症”。它是由α－变形菌门（α-Proteobacteria）中不能培养的革兰氏阴性菌CadidatusLiberibacter引发的，它们共有三个亚种，分别是CadidatusLiberibacter asiaticus（缩写为CLas），CadidatusLiberibacter africanus（缩写为CLaf）CadidatusLiberibacter americanus（缩写为CLam），分别引发亚洲柑橘黄龙病，非洲柑橘黄龙病及美洲柑橘黄龙病。柑橘黄龙病没有特异性病症，而且至今还没有研发出能根治柑橘黄龙病特效药，因此对该病的防控主要依赖早期诊断性检测。

关于柑橘黄龙病菌的检测技术，此前一直根据此病菌的16S rDNA基因采用普通PCR和荧光定量PCR。该两种方法都存在缺陷，普通PCR由于灵敏度过低，经常漏检，而荧光定量PCR又由于灵敏度过高造成检测出大量的假阳性（Kunta, M., J.V. da Graça, N.Malik, E. S. Louzada, and M. Sétamou. 2014. Quantitative distribution ofCandidatus Liberibacter asiaticus in the aerial parts of the HLB-infectedcitrus trees in Texas. HortScience 49: 65-68.）。

因此有必要建立一种精准的柑橘黄龙病检测技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种柑橘黄龙病菌快速而精准的PCR检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种柑橘黄龙病菌亚洲种的巢式PCR检测方法，其特点是：根据柑橘黄龙病菌外膜蛋白基因（OMP）在同一亚种内高度保守性原理设计两对特异性引物（F3/B3和F1/B1）对待测样品进行巢式PCR扩增，最后电泳鉴定；特异性引物为：

第一对引物F3/B3:正向引物：5’-GGTTATGCTGCCGTTAAAGTGTC-3’

反向引物: 5’-AACCAGCCCTTTCAGGAACAAG-3’

第二对引物F1/B1:正向引物：5’-TCTGAGGGTGAGCGTAAAACAACTG-3’

反向引物: 5’-TTGGGAAATAGAATGGCTGCTGAAT-3’。

进一步地，所述的柑橘黄龙病菌的巢式PCR精准检测方法，具体如下：