[发明专利]一种临床检测低丰度miR-33a/b的B-RCA方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于B-RCA技术的miR-33a/b检测试剂盒，其特征在于：包含用于检测miR-33a/b的闭锁探针，用于检测内参基因的闭锁探针，以及第二引物；

所述的用于检测miR-33a/b的闭锁探针的序列如下：

5'-PO₄-TACAATGCACTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTTGCAATGCAAC-3'；

所述的第二引物的序列如下：

5'-CATTTCAGTTTACGGTTTAGC-3'。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的内参基因为U6，用于检测内参基因的闭锁探针的序列如下：

5'-PO₄-CTTCACGAATTTTTTGCATTTCAGTTTACGGTTTAGCATTTCGCAATTTTAAAATATGGAACG-3'。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：包含阴性对照和阳性对照，阴性对照为不含miR-33a/b的质控品或不含总RNA的质控品，阳性对照为含有miR-33a/b标准品的质控品或含有总RNA的质控品。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：T4 DNA连接酶、phi29 DNA聚合酶、dNTPs、荧光染料EvaGreen和DEPC-H₂O。

5.权利要求1-3任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：提取待测样本总RNA；配制包含待测样本总RNA、闭锁探针的体系进行连接反应第一步；在连接反应第一步的反应产物中加入T4 DNA连接酶和T4 DNA连接酶缓冲液进行连接反应第二步；在连接反应第二步的反应产物中加入第二引物、phi29 DNA聚合酶、phi29 DNA聚合酶缓冲液、dNTPs和EvaGreen荧光染料形成B-RCA反应体系进行B-RCA反应；检测B-RCA反应产物的荧光强度。

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：

所述的连接反应第一步的体系为：总RNA 0.5μL，闭锁探针1μL，DEPC-H₂O 7μL；

所述的连接反应第二步的体系为：连接反应第一步产物、T4 DNA连接酶0.5μL、T4 DNA连接酶缓冲液1μL；

所述的B-RCA反应的体系为：连接反应第二步产物10μL、第二引物2μL、phi29 DNA聚合酶0.5μL、phi29 DNA聚合酶缓冲液2μL、dNTPs 2μL、EvaGreen 1μL、DEPC-H₂O 2.5μL。

7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：

所述的连接反应第一步的反应条件为：55℃5min，39℃30min；

所述的连接反应第二步的反应条件为：16℃3h，4℃过夜；

所述的B-RCA反应的反应条件为：30℃3h，65℃10min。

8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于：所述的B-RCA反应产物的荧光强度的检测条件为：B-RCA反应后产物放置4℃60min再检测荧光强度，激发波长480nm，发射波长530nm。