[发明专利]水稻E3泛素连接酶在检测植物细胞核亚细胞定位中的应用

说明书

本发明属于生物技术领域，提供水稻E3泛素连接酶在检测植物细胞核亚细胞定位中的应用，本发明主要基于水稻泛素融合蛋白与荧光蛋白分子融合，结合荧光显微镜报告蛋白在细胞器中的定位。所述蛋白细胞核定位检测方法主要由指示蛋白UF和GFP组成的融合蛋白，所述融合蛋白与待测蛋白的荧光颜色不同，检测待测蛋白是否定位在细胞核。该方法可以通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在植物细胞内瞬时表达融合蛋白，对融合蛋白进行荧光观察，能具体指示细胞核细胞器，结果判定简单、快捷，同时可消除在使用DAPI指示细胞核定位的过程中接触高毒致癌物质，提高操作的安全性等优势。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻E3泛素连接酶在检测植物细胞核亚细胞定位中的应用。

背景技术

在机体内，泛素-蛋白酶体能够特异性识别经过泛素化修饰的靶蛋白并对其进行降解进而激活由靶蛋白介导的机体内整个信号通路。E3泛素连接酶是一个种类繁多的大家族，在整个泛素化过程中主要负责与靶蛋白的特异性识别，将泛素分子连接到靶蛋白的赖氨酸残基上，形成了多聚泛素链，完成对靶蛋白进行泛素化修饰，并参与各种生命过程，包括植物生长发育、逆境胁迫反应及植物与病原物的相互作用。而对于病原物无论是病毒、细菌或者是真菌与植物的互作成为了多年的研究重点。植物的细胞器在植物细胞生长、发育过程中起着非常重要的作用，因此，病原物编码的蛋白是如何借助植物细胞器中的蛋白来抑制植物生成是这几年的研究热点。

在植物的细胞器中，细胞核是细胞内最大、最重要的细胞器，作为细胞的调控中心控制细胞的遗传、生长和发育，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用。在细胞核中包含了细胞的大多数遗传物质以及抗性蛋白、转录因子、转录调控因子等成分，在调控各种生物学过程中起着重要的作用。一些植物病原物通过与植物细胞核结合来影响植物的生长和发育，因此，存在于细胞核及定位在细胞核的蛋白也成为了研究热点的对象。

在研究细胞核定位的技术上，虽然DAPI可以染细胞核，但是DAPI属于强烈致癌物质，给操作带来繁琐的防护步骤，而利用农杆菌介导的瞬时表达系统，在植物细胞内瞬时表达融合蛋白，对融合蛋白进行荧光观察，能具体指示细胞核细胞器，具有结果判定简单、快捷且避免了接触高毒致癌物质，安全等优势，提高操作的安全性等优势。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻E3泛素连接酶在检测植物细胞核亚细胞定位中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

水稻E3泛素连接酶在检测植物细胞核亚细胞定位中的应用。所述连接酶为E3泛素连接酶UF蛋白；编码所述的E3泛素连接酶UF蛋白的基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示；将E3泛素连接酶UF蛋白，融合了绿色荧光GFP，即GFP-OsUF，作为指示植物蛋白定位于细胞核的一种Marker蛋白。

基于水稻E3泛素连接酶的植物细胞核亚细胞定位检测方法，检测方法包括如下：

（1）将GFP-OsUF质粒用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，待其长出阳性单菌落后，将单菌落接种到3ml液体LB培养基中，然后放于28℃、200rpm/min摇床中扩大培养，直至OD600=1.6后，再取GFP-OsUF农杆菌菌液20μL接种到3ml液体LB培养基中，然后放于28℃、200rpm/min摇床中活化培养，直至OD600=0.8-1.0；

（2）注射缓冲液配置：配制缓冲液，取0.5 mL10mM MgCl2、0.5 mL 10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、2.5g 30 mM葡萄糖、50μL 0.2m乙酰丁香酮至50ml 无菌管中，并水补平至50mL；

（3）将步骤（1）得的扩大培养的菌液在4000 g室温离心10 min，弃上清，加1.5 mL注射缓冲液吹悬菌液，然后取100 μL悬菌液加900 μL注射缓冲液，混匀测OD600，最后使用注射缓冲液稀释菌体浓度为OD600=1.0，得农杆菌渗透悬浮液；