[发明专利]水稻E3泛素连接酶在检测植物细胞核亚细胞定位中的应用有效
| 申请号： | 201810273463.3 | 申请日： | 2018-03-29 |
| 公开（公告）号： | CN108642127B | 公开（公告）日： | 2022-05-03 |
| 发明（设计）人： | 丁作美;吴建国;张超;石超南;王媛媛 | 申请（专利权）人： | 福建农林大学 |
| 主分类号： | C12Q1/25 | 分类号： | C12Q1/25 |
| 代理公司： | 福州元创专利商标代理有限公司 35100 | 代理人： | 蔡学俊 |
| 地址： | 350002 福*** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 水稻 e3 连接酶 检测 植物 细胞核 细胞 定位 中的 应用 | ||
1.水稻E3泛素连接酶在检测本氏烟草细胞核亚细胞定位中的应用，其特征在于：所述连接酶为水稻E3泛素连接酶UF蛋白，编码所述的E3泛素连接酶UF蛋白的基因的CDS序列如SEQ ID NO.1所示；将E3泛素连接酶UF蛋白，融合绿色荧光GFP，即GFP-OsUF，作为指示本氏烟草细胞核的一种Marker蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：检测方法包括如下：
（1）将GFP-OsUF质粒用液氮冻融法转入农杆菌GV3101中，待其长出阳性单菌落后，将单菌落接种到3ml液体LB培养基中，然后放于28℃、200rpm/min摇床中扩大培养，直至OD600=1.6后，再取GFP-OsUF农杆菌菌液20μL接种到3ml液体LB培养基中，然后放于28℃、200rpm/min摇床中活化培养，直至OD600=0.8-1.0；
（2）注射缓冲液配置：配制缓冲液，取0.5 mL10mM MgCl2、0.5 mL 10mM 2-(N-吗啡啉)乙磺酸、2.5g 30 mM葡萄糖、50μL 0.2m乙酰丁香酮至50ml 无菌管中，并水补平至50 mL；
（3）将步骤（1）得的扩大培养的菌液在4000 g室温离心10 min，弃上清，加1.5 mL注射缓冲液吹悬菌液，然后取100 μL悬菌液加900 μL注射缓冲液，混匀测OD600，最后使用注射缓冲液稀释菌体浓度为OD600=1.0，得农杆菌渗透悬浮液；
（4）用一次性注射器吸取农杆菌渗透悬浮液注射，选取健壮4-6叶期本氏烟草，在叶片背部注射，菌液渗透整个叶片，注射后注意植物的保湿；
（5）结果判定：注射后48-72h, 取注射部分叶片在共聚焦或者荧光显微镜下观察，GFP-OsUF注射叶片区域呈现绿色球状，球状位置即为细胞核；观察其他融合蛋白是否定位在细胞核上，则观察细胞核位置颜色是否发生变化，GFP-OsUF与其他融合蛋白的荧光颜色不同。
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