[发明专利]苯丙氨酸羟化酶基因突变谱检测的特异性引物

说明书

本发明公开一种苯丙氨酸羟化酶基因突变谱检测的特异性引物，属于分子生物学技术领域，包括13对引物，扩增区域为13个外显子及其侧翼区。本发明的基因引物具有相应的特异性，长度合适，扩增高效，不会形成二级结构和发夹结构，无假引发。利用该引物采用分层研究的方法进行先证者PAH基因突变分析，方法简单高效、经济实用。该发明为开展PKU病因分子机制研究提供了方法。

技术领域

本发明涉及一种苯丙氨酸羟化酶基因突变谱检测的特异性引物，属于分子生物学技术领域。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria，PKU)是一种常染色体隐性遗传病。中国人群中PKU的发病率为1/11000。该病是由于苯丙氨酸羟化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突变导致PAH活性降低或丧失，苯丙氨酸(phenylatanine，Phe)在肝脏中代谢紊乱而致病，严重者可引起智力障碍或死亡。该病的确诊依靠检测血清中苯丙氨酸的浓度，正常浓度小于120μmol/L(2mg/dl)，经典型PKU大于1200μmol/L。治疗主要是终生低苯丙氨酸饮食。

PKU是第一个被诊断的引起精神发育迟缓的代谢性疾病。早在1934年PKU即被发现，随后被命名。六十年代，一种简单的实验室技术Guthrie细菌抑制实验应用于新生儿筛查，给患儿的治疗带来了希望。目前中国许多城市已经开展了新生儿PKU筛查，对于确诊病例，早期给予低苯丙氨酸饮食，患者的预后大为改善。然而由于基因检测手段的限制，PKU的病因分子机制的研究却一直滞后。直到上世纪八十年代，人类PAH基因的cDNA序列被成功克隆，定位于12号染色体，见图1。GenBank收录号：NM_000277(mRNA)；U49897.1(cDNA)。这些成果为PKU的分子机制的研究打下了基础。近年来，随着基因突变检测技术的不断改进，新发现的PAH突变种类也越来越多。截止目前PAH数据库(http://www.pahdb.mcgill.ca)报道世界范围内PAH突变种类有567种，我国国内报道的突变种类也有100余种。不同地区、不同民族PAH基因突变谱差异很大，表现出突变的多样性。例如欧美的PKU人群的高频率突变集中于外显子12和11及其侧翼区，如R408W、IVSl2+lG>A和IVS10-11G>A。中国PKU人群在第7外显子及其侧翼区，突变频率最高的p.R243Q。国外的数据不能直接用作国内PKU病因研究的依据。而国内因地区差异，突变情况也各不相同。因此，对一个地区的PKU患者进行PAH全基因突变筛查，建立本地区人群的突变谱十分有意义。目前淮海地区PAH基因突变研究文献较少。本研究对临床已确诊的101例汉族PKU患儿的PAH基因的13个外显子及其两侧部分内含子进行突变分析，探讨淮海地区汉族PKU患者PAH基因突变类型、频率及分布特点，该成果虽然不能直接用于PKU的诊断和治疗，但丰富了中国汉族人群PAH基因突变数据库，为开展PKU病因分子机制研究提供依据。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种苯丙氨酸羟化酶基因突变谱检测的特异性引物，具有相应的特异性，长度合适，扩增高效，不会形成二级结构和发夹结构，无假引发。该检测引物为开展PKU病因分子机制研究提供了依据。

为了实现上述目的，本发明设计的一种苯丙氨酸羟化酶基因突变谱检测的特异性引物，包括13对引物，扩增区域为13个外显子及其侧翼区，将这13个位点命名为C1-C13，具体的引物序列分别为：

所述苯丙氨酸羟化酶基因C1位点，扩增区域为474-533，扩增引物序列是F1:acgaggggcgttactgtg和R1:ccaggaagcaccagcag；

所述苯丙氨酸羟化酶基因C2位点，扩增区域为4614-4863，扩增引物序列是F2:agagttcatgcttgctttg和R2:tggaagtttgctacgacat；