[发明专利]一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆及其构建方法和应用。所述的猪细小病毒的全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。通过该全长感染性DNA能够拯救出与PPV野毒具有相似生长特性的拯救病毒，并且在全长感染性克隆中引入遗传标记EcoRv，该标记在传代之后依然能够稳定存在，可以作为鉴定野毒与拯救病毒可靠的遗传标志。此外，本发明还建立了的猪细小病毒反向遗传学操作系统，可用于猪细小病毒蛋白的毒力分析，并据此可以制备新型灭活疫苗或弱毒疫苗。本发明的提出为研究猪细小病毒基因结构与功能及致病性研究等方面提供平台，也为研究针对猪细小病毒病的疫苗等奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种病毒感染性克隆及其构建方法，特别涉及一种猪细小病毒的全长感染性克隆及其构建方法，还涉及猪细小病反向遗传学操作系统的建立。本发明属于生物技术领域。

背景技术

猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是细小病毒科细小病毒属的成员，是引起母猪繁殖障碍的病原。1966年，Mayr进行猪瘟病毒组织培养时发现了PPV。Cartwright和Huck于1967年首次在英国猪流产胎儿的脏器中分离出猪细小病毒以来，现已在比利时(1967)、德国(1968)、美国(1972)、日本(1972)、荷兰(1972)、澳大利亚(1973)、芬兰(1979)、法国(1977)和加拿大(1978)等国都有相继的报道。在我国，猪细小病毒发现较晚，但是流行情况却相当普遍。临床上，该病毒不仅可以导致初孕母猪的繁殖障碍，而且还能引起仔猪的皮肤炎症和肠炎性腹泻，给世界各国的养猪行业造成了巨大的经济损失。

根据ICTV第九次分类报告，PPV属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属。PPV与多数细小病毒一样，对外界理化因素具有很强大的抵抗力，耐热能力极强，据Cartwright等的试验，当56℃30min加热处理时，无论病毒的传染性还是凝集红细胞的能力，都无明显改变；70℃2h感染力有所下降，但并不丧失；80℃5min即可失去活性。对脂、酶溶剂及有机溶剂抵抗力强，耐酸范围大，感染能力在pH3.0～10.0范围内没有明显的改变。具有血凝性，能凝集人、猴、豚鼠和鸡的红细胞，对豚鼠红细胞凝集效果最好。

细小病毒都在细胞核内增殖。依赖病毒属除外，其它细小病毒均能自我复制，但是需要依赖宿主细胞有丝分裂过程中的某些功能。所以体外培养该病毒时，必须在细胞传代培养的同时或最迟24h内接种病毒，即同步接毒，才能达到病毒良好增殖的目的。PPV只能在来源于猪的细胞和人的某些传代细胞中增殖培养，其中以猪的原代肾细胞较为常用。PPV在PK-15细胞系中培养，当接种时机适当时，于2～5天出现细胞病变，7～8天达到收获程度。

PPV与其它细小病毒具有共同的形态结构特征，外观呈六角形或圆形，无囊膜，直径20～23nm，二十面体等轴立体对称，衣壳约由32个壳粒组成，核心含有单股线状DNA，分子量为1.4×10⁶，G+C＝48％，DNA约占整个病毒粒子的26.5％，病毒在氯化铯中的浮密度为1.37～1.39g/cm³。PPV基因组是单链线状DNA分子，大小约5000nt。根据GenBank报道的序列，PPV全长基因组为5075nt(序列号：NC_001718)。