[发明专利]一种猪细小病毒的全长感染性DNA克隆及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)的全长感染性DNA，其特征在于，所述的全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.含有权利要求1所述全长感染性DNA的载体。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，出发载体为pBluscript II SK(+)。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述的载体通过以下方法制备得到：

(1)改造载体pBluscript II SK(+)

在pBluscript II SK(+)载体中的Kpn I与SacI酶切位点之间增加Afe I以及Stu I酶切位点；

(2)全长感染性DNA的合成

合成PPV基因组3’末端长度为114bp的片段，即片段I，通过Kpn I以及Afe I酶切位点克隆到改造后的pBluscript II SK(+)载体上；合成与片段I相连的PPV基因组3’端长度为65bp的片段，即片段II，通过Infusion克隆技术与片段I连接；用Stu I线性化含PPV基因组3’端片段的载体；根据猪细小病毒基因组相对保守区设计三对引物，扩增猪细小病毒基因组中间的非发夹结构，三对引物序列分别如SEQ ID NO.2和3、SEQ ID NO.4和5以及SEQ IDNO.6和7所示；通过Over-lap PCR将三段片段连接起来，得到片段III；将片段III克隆到pEASY-Blunt载体上；将片段III中3193bp处的碱基A突变成碱基G，引入EcoRv位点作为遗传标记拯救病毒；设计引物Infusion III SF，Infusion III SR，引物序列如SEQ ID NO.8和9所示，扩增突变过的片段III；合成PPV 5’端长度为238bp的片段克隆到pMD-19T载体中，设计引物Infusion IV SF，Infusion IV SR，引物序列如SEQ ID NO.10和11所示，扩增PPV基因组5’端片段，即片段IV；用Infusion克隆技术将线性化的含PPV基因组3’端片段的载体，突变过的片段III及PPV基因组5’端片段IV无缝连接起来，得到的重组质粒命名为pPPV，其中，最终合成的猪细小病毒全长感染性DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

5.含有权利要求1所述的全长感染性DNA或权利要求2-4任一项所述载体的宿主细胞。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞为PK-15细胞。

7.一种猪细小病毒的反向遗传学操作系统，其特征在于，所述的系统包括权利要求2-4任一项所述的载体以及宿主细胞。

8.如权利要求7所述的反向遗传学操作系统，其特征在于，所述的细胞为PK-15细胞。

9.权利要求7或8所述的反向遗传学操作系统在PPV病毒拯救、PPV的致病机理和致病力研究以及PPV疫苗研制中的应用。

10.一种拯救猪细小病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：接种PK-15细胞于六孔板中，培养至细胞密度为80％-90％时进行转染：每孔中加入权利要求2-4任一项所述载体和Lipofectamine 2000转染试剂，在Opti-MEM中震荡混匀，进行转染，并且逐日观察细胞病变，收取细胞转染物反复冻融三次并盲传，收取病毒细胞培养物反复冻融三次后，得到拯救病毒，置于-70℃保存备用。