[发明专利]一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒，属于生物技术领域。该引物是根据本实验室分离鉴定并测序的树鼩全基因组3′端保守序列设计合成，与树鼩源及其他物种常见病毒无交叉反应，探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。通过本发明试剂盒检测，所得结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。也可以应用于树鼩腺病毒引起的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针和试剂盒，更具体涉及一种检测树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR引物和探针，同时还涉及树鼩腺病毒的TaqMan实时荧光定量PCR 检测试剂盒，该TaqMan实时荧光定量PCR试剂盒可高效方便的对各种生物材料的树鼩源腺病毒进行定量检测和质量监控，也可以进行树鼩腺病毒的流行病学调查，还可以为相关基础研究提供技术支持，应用前景十分广泛。

背景技术

树鼩腺病毒 (Tree Shrew Adenovirus，TAV)属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属。腺病毒无囊膜，病毒粒子为二十面体，直径为80～110nm，由252个壳粒组成。一般感染哺乳动物的腺病毒相对分子质量为20～25×10⁶，G+C含量为48%～61%。迄今，已发现有100多种腺病毒能感染人、哺乳动物和禽类。腺病毒分布十分广泛，一般对于人体没有致癌性，但是腺病毒感染会引起急性上呼吸道感染、急性眼结膜炎、急性出血性膀胱炎、腹泻等疾病。前期开展的相关研究表明，野生来源树鼩中腺病毒携带率较高，并有疑似病例发生，被列为树鼩实验动物微生物质量控制的检测指标之一。因此，建立一种高效、快速，可反应个体病毒载量的实时荧光定量PCR方法势在必行。

目前检测技术一般来说有血清学诊断技术、生物学试验、分子生物学诊断技术三类：a）血清学诊断技术包括免疫荧光技术（IFA）、双抗体夹心ELISA检测等。但由于所有实验均用到抗血清和抗原免疫反应，所以反应时间长、材料多、准备周期长，而且检测具有明显的滞后性，只能定性不能定量，而且重复性差。b)生物学试验包括动物实验和细胞培养。这种检测方法存在不敏感问题，而且有些样品存在抗补体活性，影响检测效果。动物实验成本较高、检测周期长，耗费大量生物资源和人力物力。c)分子生物学诊断技术，即应用PCR技术检测树鼩腺病毒持续感染。相比之下，PCR方法特异性好，检测灵敏度高，不但可以检测活病毒核酸，也能直接检测灭活的核酸片段。但普通的PCR检测方法测定的都是PCR的终产物，而不是起始的DNA或RNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以无法定量起始的DNA或RNA拷贝数。

近年发展起来的实时荧光定量PCR技术(Real-time fluorescence quantitativePCR)有灵敏度高、速度快、特异性好等优点。目前使用比较多的是SYBR Green I荧光染料法和Taqman法。两种方法都具有灵敏度高、检测速度快、特异性好的优点。在基因表达水平分析、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用，并且已成为当前病毒核酸定量的主要方法。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物、探针及方法和试剂盒，该方法简单方便、灵敏度高且检测时间短，同时，本发明试剂盒适用于目前市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，结果更加准确、可靠、稳定性好、重复性好。灵敏度高、定量快速准确、检测范围广。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种检测树鼩腺病毒的实时荧光定量PCR引物，核苷酸序列为：

上游引物：5′-AAAGAATGCCCACCTCCCAT-3′，

下游引物：5′-CAGTGGCAGGCCATTAAGC-3′。

本发明还提供与所述引物配合使用的探针，核苷酸序列为：