[发明专利]一种福寿螺GK小干扰RNA表达载体及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种福寿螺GK小干扰RNA表达载体及其构建方法和应用，包括以下步骤：(1)通过RACE技术克隆得到福寿螺GK基因全长cDNA序列；(2)根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物；(3)siRNA引物退火；(4)RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接；(5)转化大肠杆菌，得到RNAi表达载体的重组质粒。福寿螺为重要的外来入侵物种，本发明构建的GK小干扰RNA表达载体对于GK基因在外来入侵生物福寿类耐逆机制的研究方面具有重要的理论及实际意义。

技术领域

本发明属于淡水生物分子生物学技术领域，尤其涉及一种福寿螺GK小干扰RNA表达载体的及其构建方法及和应用。

背景技术

福寿螺(Pomacea)又名大瓶螺、苹果螺，是国际性的恶性有害生物。该螺原产于南美洲亚马逊河流域，上世纪80年代初期引入亚洲，因管理不善和口味不佳被弃养；福寿螺迅速扩散到田间，部分地区泛滥成灾，对水稻、茭白等水生作物造成严重的危害(Naylor，1996)。福寿螺具有极强的繁殖力，扩散和蔓延速度快，目前已成为长江以南大部分省区的严重农业有害生物(俞晓平等， 2001)。福寿螺虽原产于亚热带，但福寿螺入侵到世界各地后，逐步形成了不同温度耐受性的地理种群(董胜张等，2010)。在我国北纬30°以南的大部分省区，都有福寿螺的存在，目前我们在江苏许多地点也发现了福寿螺，这表明了福寿螺对温度具有广泛的适应性。然而,相对于高温而言,冬季低温往往成为福寿螺种群进一步扩张的限制因子(Ito K,2002)。葡萄糖激酶(GK)是糖酵解过程中的限速酶，在福寿螺应对低温胁迫的过程中发挥中重要作用。

RNA干扰(RNAi)技术作为一种新的基因阻断技术，具有技术成熟，成本低，高效等特点，已经成为研究基因功能的一种有力工具。

发明内容

本发明的目的在于提供一种福寿螺GK小干扰RNA(siRNA)表达载体的构建方法，以及该小干扰RNA表达载体的用途。

本发明通过以下技术方案完成：

一种福寿螺GK小干扰RNA表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：

(1)通过RACE技术克隆得到福寿螺GK基因全长cDNA序列；

(2)根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的 siRNA引物；

(3)siRNA引物退火；

(4)RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接；

(5)转化大肠杆菌，得到RNAi表达载体的重组质粒。

在上述方案基础上，各步骤可以采用如下具体方式实现：

所述的9个核苷为:TTCAAGTAT。所述的4对siRNA引物分别为：

引物I:

F:5'-AAGCCTCAAAGTTTCAAGTATGTATCGAGT-3'

R:5'-AATGTTGGCCGTAAGTTCATACAAGTCAGACT-3'

引物II:

F:5'-AAGTGGAATCAATTCAAGTATGTGCTAAGT-3'

R:5'-AATGTTGGCCGTTATGAACTT CAAGTCAGACT-3'

引物III：

F:5'-AACTCCGAAAGTTTCAAGTATGTATGAGCTA-3'

R:5'-AATGTTGGCCGTGAACTTTAT CAAGTCAGACT-3'