[发明专利]一种福寿螺GK小干扰RNA表达载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种福寿螺GK小干扰RNA表达载体的构建方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)通过RACE技术克隆得到福寿螺GK基因全长cDNA序列；

(2)根据载体的信息和靶序列设计并合成4对含9个核苷酸的loop环的siRNA引物；

(3)siRNA引物退火；

(4)RNAi表达载体的构建：siRNA引物退火后与双酶切的RNAi载体连接；

(5)转化大肠杆菌，得到RNAi表达载体的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的9个核苷为:TTCAAGTAT。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4对siRNA引物分别为：引物I:

F:5'-AAGCCTCAAAGTTTCAAGTATGTATCGAGT-3'，如SEQ ID NO:5所示；

R:5'-AATGTTGGCCGTAAGTTCATACAAGTCAGACT-3'，如SEQ ID NO:6所示；

引物II:

F:5'-AAGTGGAATCAATTCAAGTATGTGCTAAGT-3'，如SEQ ID NO:7所示；

R:5'-AATGTTGGCCGTTATGAACTT CAAGTCAGACT-3'，如SEQ ID NO:8所示；

引物III：

F:5'-AACTCCGAAAGTTTCAAGTATGTATGAGCTA-3'，如SEQ ID NO:9所示；

R:5'-AATGTTGGCCGTGAACTTTATCAAGTCAGACT-3'，如SEQ ID NO:10所示；

引物IV：

F:5'-AAGTTAGCCATGTTCAAGTATGTATCGAGT-3'，如SEQ ID NO:11所示；

R:5'-AATGAACAATGTTTCAAGTATCAAGTCACT-3'，如SEQ ID NO:12所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)为：将表达载体pSilencer2.1-U6 hygro进行BamH I和Hind III双酶切后，与siRNA引物退火后得到的DNA片段连接，采用热激转化大肠杆菌。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)为：利用CODEHOP设计并合成福寿螺GK基因特异性引物,利用RACE技术克隆得到福寿螺GK基因5'端序列和3端序列,拼接后得到福寿螺GK基因全长cDNA序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的特异性引物P1-P4是：

P1:5'-CGCTCAGGTCGTAGTAGCAGAAGGTC-3'，如SEQ ID NO:1所示；

P2:5'-CGGGAACGGAATGTGAAGAAAGAAGC-3'，如SEQ ID NO:2所示；

P3:5'-GGCTTCTTTCTTCACATTCCGTTCCC-3'，如SEQ ID NO:3所示；

P4：5'-TGCCTTTCAGGATTACATCACCCG-3'，如SEQ ID NO:4所示；。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤(5)所得到RNAi表达载体的重组质粒利用PCR技术进行阳性鉴定。

8.一种根据权利要求1～7任一所述方法构建的福寿螺GK小干扰RNA表达载体。

9.一种利用权利要求8所述载体分析GK基因在福寿类应对低温胁迫中作用的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)将所述的siRNA表达载体转化大肠杆菌DH5α，37℃，150-200RPM培养12小时后，进行质粒抽提，获得高纯质粒；

(2)将(1)获得的高纯质粒转染福寿螺心组织细胞系，28℃培养12小时后更换新的培养基；

(3)分别在转染后0，6，12，24，72，120小时收集细胞，提取总RNA，分析siRNA表达载体对GK基因表达的影响以及GK的功能。