[发明专利]一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用

说明书

本发明涉及一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其包括用于检测Spetin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针以及内参ACTB的引物对和探针，所述引物对和探针的序列如SEQ ID No：1‑SEQ ID No：18所示。本发明还提供了一种含有上述引物对和探针的试剂盒及其应用，该应用方法包括血浆标本游离DNA提取、亚硫酸盐转化、PCR扩增反应及荧光信号检测和结果判定。本发明所述的试剂盒及方法适用于定性检测人外周血中Spetin9、THBD、SDC2、NDRG4和BMP3五个基因的甲基化检测，其与常规的结直肠癌诊断方法相比，本发明充分利用了血浆游离DNA提取、DNA甲基化处理和QPCR相关联技术，开发出具有高灵敏度性、高特异性的试剂盒，对人结直肠癌进行早期无创筛查。

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠癌是人类消化系统中最常见的恶性肿瘤之一，据统计，结直肠癌的发病率居全球恶性肿瘤第3位，随着人们生活习惯的改变，结直肠癌的发病率和死亡率均明显上升，严重威胁人类的健康。结直肠癌发生的病因尚不明确，一般认为是多因素、多步骤的过程。因此，深入研究结直肠癌发生发展的分子机制，对揭示结直肠癌的发病机制、疾病预防、明确诊断、药物合理应用和判断预后有重要意义，有助于提高我国结直肠癌诊治水平和降低发肠癌的发病率和死亡率。现如今DNA甲基化已成为公认的肿瘤发生的机制之一，DNA甲基化是在未改变DNA序列的情况下在CpG岛5'端胞嘧啶加上甲基基团，从而使该DNA的表达沉默，导致病变的发生。在离体实验中，用某些药物可以使甲基化的基因去甲基化，从而使该基因重新活化，因此，研究基因启动子区的甲基化，将为恶性肿瘤的治疗提供有意义的靶点，另外，DNA异常甲基化要早于细胞恶变的发生，可以预测肿瘤的发生，从而为结直肠癌的诊断和治疗提供重要依据。

在正常基因组上，70％～80％的CpG均发生甲基化，而CpG岛(启动子上富含CpG的区域)通常未发生甲基化。在肿瘤组织上则相反，表现为全基因组的低甲基化和启动子区域，特别是抑癌基因启动子的过度甲基化。全基因组的低甲基化可引起基因组的不稳定及可激活正常情况下沉默的基因区域如原癌基因，启动子区域的过度甲基化则使抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期控制基因、调亡基因等发生异常沉默。研究表明，结直肠癌可有多种基因的异常甲基化，这些基因的启动子发生高甲基化后被沉默，进而促进结直肠癌的形成与发展。肿瘤组织的多启动子甲基化可形成CpG岛甲基化表型(CpG island methylatorphenotype，CIMP)，CIMP与老年、女性、结直肠癌家庭史、近端结肠、黏液性细胞的分化、特异性癌前病变、吸烟、MSI及KRAS和BRAF突变相关。结直肠癌的发生和发展是一个多步骤的过程，DNA异常甲基化可贯穿于肿瘤发展的所有阶段。研究显示，至少有6种甲基化基因(SLC5A8、SFRP1、SFRP2、CDH13、CRBP1和RUNX3)和2个甲基化位点(MINT1和MINT31)存在于正常结肠上皮组织到异常肠隐窝病灶阶段；其他一些基因(p14、HLTF、ITGA4、CDKN2A/p16、CDH1和ESR1)常发现于从异常肠隐窝病灶到息肉或腺瘤的阶段；而TIMP3、CXCL12、ID4和IRF8基因可出现在息肉到癌变组织的阶段；DNA修复基因MGMT和hMLH1甲基化在从息肉到癌变的过程亦起着重要的作用。基质细胞中编码SPARC基因的甲基化与结直肠癌的淋巴管浸润转移相关。