[发明专利]一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其特征在于，包括分别用于检测Septin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2基因甲基化的引物对和探针；其中

用于检测Spetin9基因甲基化的引物对为SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示序列，探针为SEQ ID No：3所示序列；

用于检测NDRG4基因甲基化的引物对为SEQ ID No：4和SEQ ID No：5所示序列，探针为SEQ ID No：6所示序列；

用于检测BMP3基因甲基化的引物对为SEQ ID No：7和SEQ ID No：8所示序列，探针为SEQ ID No：9所示序列；

用于检测THBD基因甲基化的引物对为SEQ ID No：10和SEQ ID No：11所示序列，探针为SEQ ID No：12所示序列；

用于检测SDC2基因甲基化的引物对为SEQ ID No：13和SEQ ID No：14所示序列，探针为SEQ ID No：15所示序列；

所述引物对和探针还包括内参ACTB的引物对和探针，其中内参ACTB的引物对为SEQ IDNo：16和SEQ ID No：17所示序列，探针为SEQ ID No：18所示序列。

2.根据权利要求1所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针，其特征在于，各所述探针的5'端标记有荧光报告染料，3'端标记有淬灭荧光染料，所述荧光报告染料选自FAM、ROX、CY5、VIC、HEX、JOE，所述淬灭荧光染料选自BHQ、TAMRA。

3.一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，包括游离DNA提取试剂、亚硫酸盐转化试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂、阳性对照品、阴性对照品；其中，所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括如权利要求1～2中任一项所述的引物对和探针。

4.根据权利要求3所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，所述游离DNA提取试剂包括裂解液、蛋白酶混合液、磁珠、洗涤液和洗脱液；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂还包括PCR扩增缓冲液、UNG酶和DNA聚合酶；阳性对照品采用牛血清白蛋白、人基因组DNA，阴性对照品采用DEPC H₂O。

5.根据权利要求4所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，每一对应的引物对与探针的摩尔比为2：1，每一引物对的各引物的终浓度均为200nM，各探针的终浓度均为100nM。

6.根据权利要求4所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，使用所述试剂盒的检测方法包括如下检测步骤：

步骤1)收集样本，并将样本混匀后进行游离DNA的提取；

步骤2)对步骤1)提取的DNA样本进行亚硫酸盐转化；

步骤3)采用所述的引物对和探针对步骤2)亚硫酸盐转化后的DNA样本进行实时荧光定量PCR扩增反应；

步骤4)对步骤3)PCR扩增完成的DNA样本进行荧光信号检测和结果判定。

7.根据权利要求6所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，所述步骤3)中PCR扩增的反应条件是：50℃UNG酶反应2min；95℃变性5min；95℃变性5s，55℃退火和延伸35s，45个循环。

8.根据权利要求6所述的用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的试剂盒，其特征在于，DNA样本的结果判定步骤如下：如果单次PCR扩增中Septin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因中的至少两个基因为阳性，则样本的测试结果为“阳性”；如果单次PCR扩增中Septin9、NDRG4、BMP3、THBD和SDC2五个基因中的任意一个基因为阳性，则需要重复检测三次，三次结果中至少两次为阳性时，则样本的测试结果为“阳性”；如果结果为其它情况，视为无效。