[发明专利]ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法。以数字PCR为检测平台，针对3种型别的BCR/ABL融合基因，设计合成用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物和内参基因检测探针，并将待测样品cDNA模板、用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物、内参基因检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR微反应液滴进行PCR扩增反应，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有融合基因模板及其数量和含量。本发明的引物和探针的设计特异性强，结合数字PCR技术检测灵敏度更高，通过软件自动化进行结果判读，避免产生假阴性结果，因此可以用于少量白血病细胞进行检测，减少患者复发的可能。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测，尤其涉及一种ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法。

背景技术

abl为一原癌基因，位于9号染色体q34，基因产物是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶；bcr基因位于22号染色体q11，正常的bcr基因产物为160kD的胞质磷酸蛋白，由于t(9；22)(q34；q11)的易位，形成bcr/abl融合基因，该易位产生bcr/abl嵌合基因，基因产物为210kD的融合蛋白，它的表达激活了酪氨酸蛋白激酶，改变了细胞的蛋白酪氨酸水平和肌动蛋白结合能力，扰乱了正常的信号传导途径，抑制了凋亡的发生。

bcr基因断裂点集中在三个区域:主要(majorbcr，M-bcr)、次要(minorbcr，m-bcr)和μ(μ-bcr)。abl基因断裂位于第1或第2内含子。因断裂点不一，bcr-abl融合基因及其mRNA和蛋白产物呈多样性。根据bcr基因断裂点的不同，主要有下述几种类型的bcr/abl融合形式:①在典型的CML中，大部分融合基因是在主要断裂点簇集区(M-bcr)内断裂融合而成，由此形成的bcr/abl融合mRNA是由b3a2或b2a2转录而成，其最终产物是相对分子质量210×103的胞浆蛋白P210，这种癌蛋白是绝大多数慢性期CML表型异常的根源所在；②当bcr基因断裂点发生在上游的一段长约54.4kb的内含子，也称m-bcr区，产生一个e1a2接头的杂合mRNA，编码P190融合蛋白；③bcr断裂点也可在M-bcr区的下游，即μ-bcr，产生e19a2融合，编码P230融合蛋白。

bcr/abl融合基因存在于95％以上的慢性粒细胞白血病患者，是CML最重要的分标志，是疾病状态的决定性因素。在一部分成人急性淋巴细胞性白血病(20％－30％)、儿童急性淋巴细胞白血病(2％－10％)和急性粒细胞性白血病的患者中也可表达bcr/abl融合基因。

目前常用的检测BCR/ABL融合基因导致慢性髓细胞白血病(CML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)有以下5种方法，

(1)形态学检查，由于白血病细胞的高度异质性和多态性，重复性差，易受主观因素的影响，其诊断一致率约60％-80％。

(2)免疫学检测方法，主要有两种：细胞涂片法和流式细胞术(FCM)，细胞涂片法所需设备简单，可在显微镜下清楚地判断细胞抗原和抗体结合的部位，尤其对细胞内抗原进行检测时较易排除因细胞膜渗透处理带来的非特异性反应，但目测不易对大量细胞进行计数，故敏感度较低，一般为10-2，目前主要用于细胞内抗原的检测；而FCM可同时对一个细胞中2个以上的抗原进行检测，并对大量细胞进行快速分析，准确客观、简单方便，但是FCM法需特殊仪器，操作技术要求高，价格昂贵，结果的重复性欠佳。

(3)细胞遗传学检测方法，常规应用直接法或短期培养法进行染色体RHG显带，但是白血病细胞分裂指数低，染色体形态短小，常显带不清，使得一些结构复杂或细微的改变难以准确识别。