[发明专利]ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物及其检测方法

权利要求书

1.ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物和探针，其特征在于，用于检测BCR/ABLP210融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测BCR/ABL P190融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，用于检测BCR/ABL P230融合基因的上游引物序列如SEQID NO：3所示；用于检测BCR/ABLP210融合基因和BCR/ABL P190融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，用于检测BCR/ABLP230融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示；BCR/ABL融合基因检测探针序列如SEQ ID NO：6所示。

2.根据权利要求1所述的ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的引物和探针，其特征在于，所述检测BCR/ABL融合基因探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团。

3.一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)提取受试者骨髓、外周血或组织的RNA提取；

2)将步骤1)提取的RNA反转录成cDNA；

3)以cDNA为模板，将待测样品cDNA模板、用于检测BCR/ABL融合基因上下游引物、BCR/ABL融合基因检测探针、内参基因的上下游引物、内参基因检测探针以及PCR预混液混合，制备ddPCR混合液；

所述BCR/ABL融合基因包括BCR/ABL P210融合基因、BCR/ABLP190融合基因和BCR/ABLP230融合基因，用于检测BCR/ABL P210融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：1所示，用于检测BCR/ABL P190融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：2所示，用于检测BCR/ABL P230融合基因的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示；用于检测BCR/ABL P210融合基因和BCR/ABLP190融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，用于检测BCR/ABL P230融合基因的下游引物序列如SEQ ID NO：5所示；BCR/ABL融合基因检测探针序列如SEQ ID NO：6所示；内参基因的上下游引物序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示，内参基因检测探针序列如SEQID NO：9所示；

4)ddPCR混合液制作PCR微反应液滴，再进行PCR扩增反应；

5)收集信号并进行结果判读：PCR扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有融合基因模板及其数量和含量。

4.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，ddPCR混合液中cDNA模板的含量为3～8ng/μL。

5.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，ddPCR混合液中上游引物和下游引物含量均为400～700nM，BCR/ABL融合基因检测探针含量为200～400nM。

6.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，ddPCR混合液中内参基因上游和下游引物含量均为400～700nM，内参基因检测探针含量为200～400nM。

7.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，步骤4)中ddPCR混合液制作PCR微反应液滴的方法为：将ddPCR混合液加入微滴发生器，生成10000-20000个微反应液滴。

8.根据权利要求3所述的一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，步骤4)中PCR扩增反应条件为：93-97℃预变性3-15分钟；93-95℃变性5-50秒，55-60℃退火/延伸30-70秒，共进行35-45个循环，2-10℃终止反应。

9.根据权利要求8所述的一种基于ddPCR技术检测BCR/ABL融合基因的方法，其特征在于，步骤4)中PCR扩增反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，55℃退火/延伸1分钟，共进行40个循环，10℃终止反应。