[发明专利]无细胞核酸标准品及其用途

说明书

本公开内容提供了包含基因组多核苷酸的无细胞核酸标准品以及使用包含基因组多核苷酸的无细胞核酸标准品来建立、优化和验证无细胞核酸测定的方法。

交叉引用

本申请要求2016年6月23日提交的第62/353,779号美国临时专利申请的权益，该美国临时申请通过引用以整体并入本文用于所有目的。

发明背景

1948年首次描述了在血浆中存在cfDNA。最近的研究显示，一些cfDNA向血液中的释放与癌细胞的凋亡有关。已经发现，癌症患者中最丰富的cfDNA片段大小约为180个碱基对(bp)，伴随有大小为180bp的倍数的较大DNA片段，这使人联想到由凋亡细胞所示的核小体DNA片段的阶梯模式。凋亡过程中DNA裂解成核小体DNA片段是由胱天蛋白酶活化的DNA酶(CAD，也称为DFF40)介导的。CAD切割核小体之间的连接体区并留下5'-磷酸基团和3'-羟基。

快速建立cfDNA测定技术，如高通量的下一代测序(NGS)、qPCR或数字PCR，使得能够对cfDNA样品进行特征分析。然而，由于样品的可变性和技术偏差，性能评价和不同测定之间的比较可能具有挑战性。

发明内容

与从人血浆中提取的人类cfDNA非常相似的cfDNA参考标准品对于在不同平台和实验室之间评价和验证cfDNA测定非常重要。目前可用的通过机械剪切产生的“人工cfDNA”通常包含具有平端、3'-和/或5'-突出端的多核苷酸的异质混合物，突出端可能缺乏5'-磷酸基团和3'-羟基，而MNA酶消化产生5'-羟基和3'-磷酸核苷酸。因此，这些人工cfDNA可能与真正的cfDNA有不同的表现。例如，具有3'-磷酸基团和/或5'-羟基的人工cfDNA可能具有不代表体内cfDNA的不同程度的连接效率。

鉴于前述内容，需要更好地代表体内cfDNA的诸如cfDNA标准品的无细胞核酸标准品。本公开内容解决了这些需求，并且还提供了其他优点。

在一方面，提供了一种用于估算包含靶核酸和非靶核酸的无细胞核酸(CFNA)样品中存在的靶核酸的丰度的方法，所述方法包括：(a)对所述CFNA样品中的所述靶核酸的拷贝数进行定量，以获得所述靶核酸的观测丰度；(b)通过将CFNA标准品中存在的参考核酸的观测丰度与该CFNA标准品中存在的所述参考核酸的预期丰度相关联来生成校准方案，该CFNA标准品包含多个基因组多核苷酸，所述多个基因组多核苷酸中的单个成员具有5’末端和3’末端，其中：(i)所述CFNA标准品的所述多个基因组多核苷酸的至少一个子集具有范围为约100-300个碱基的长度；并且(ii)所述CFNA标准品的大多数所述基因组多核苷酸在5’末端处具有磷酸基团并且在3’末端处具有羟基，所述大多数基因组多核苷酸是可连接的而无需在5’末端处生成磷酸基团和/或在3’末端处生成羟基；以及(c)通过使用所述校准方案调整所述靶核酸的观测丰度来估算所述CFNA样品中的所述靶核酸的丰度。在一些实施方案中，所述CFNA标准品的少于50％的单个基因组多核苷酸具有相同的序列。在一些实施方案中，所述CFNA标准品包含具有相同成员的基因组多核苷酸的至少一个子集。在一些实施方案中，所述子集代表所述CFNA标准品的少于50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些实施方案中，至少30％的所述基因组多核苷酸具有范围为约100-300个碱基的长度。在一些实施方案中，至少50％的所述基因组多核苷酸在5’末端处包含磷酸基团且在3’末端处包含羟基。在一些实施方案中，基因组多核苷酸的5’末端处的磷酸基团和3’末端处的羟基不是由多核苷酸激酶生成的。在一些实施方案中，所述CFNA标准品的所述基因组多核苷酸可以以至少约50％的效率连接。在一些实施方案中，所述CFNA标准品的基因组多核苷酸可以以通过定量聚合酶链反应(PCR)测定所确定的至少约50％的效率连接。在一些实施方案中，所述CFNA标准品的所述基因组多核苷酸在不存在磷酸供体的情况下是可连接的。