[发明专利]使用栓系的核苷三磷酸的核酸合成和测序

权利要求书

1.一种结合物，其包含聚合酶和核苷三磷酸，其中所述聚合酶和核苷三磷酸通过包含可裂解的键的接头共价连接，所述聚合酶能够催化连接到聚合酶的核苷酸添加到核酸的3’端，并且所述聚合酶是非模板依赖性聚合酶。

2.权利要求1所述的结合物，其中所述聚合酶通过长度在范围内的接头连接到核苷三磷酸，并且其中所述接头的长度足以使核苷三磷酸接近聚合酶的活性位点。

3.权利要求1或2所述的结合物，其中所述核苷三磷酸连接到聚合酶中的半胱氨酸残基。

4.权利要求1或2所述的结合物，其中所述可裂解的键是光可裂解的键或酶可裂解的键。

5.权利要求1或2所述的结合物，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。

6.权利要求1或2所述的结合物，其中所述聚合酶是RNA聚合酶。

7.权利要求1或2所述的结合物，其中所述核苷三磷酸或聚合酶包含荧光标记。

8.权利要求1或2所述的结合物，其中所述核苷三磷酸是脱氧核糖核苷三磷酸。

9.权利要求1或2所述的结合物，其中所述核苷三磷酸是核糖核苷三磷酸。

10.一组任一前述权利要求所述的结合物，其中所述核苷三磷酸对应于G、A、T和C，并在不同的容器中。

11.一种核酸合成方法，包括：

用第一结合物孵育核酸，其中所述第一结合物是任一前述权利要求所述的结合物，并且所述孵育在其中聚合酶催化第一结合物的核苷酸共价添加到核酸的3’羟基上的条件下完成，以制备延伸产物。

12.权利要求11所述的方法，其中核酸栓系到载体。

13.权利要求11所述的方法，其中所述方法包括在将核苷酸添加到核酸上之后，裂解接头的可裂解的键，从而从延伸产物释放聚合酶。

14.权利要求13所述的方法，其中所述可裂解的键是酶可裂解的键或光可裂解的键，并且所述裂解包括将延伸产物暴露于酶或暴露于光。

15.权利要求13所述的方法，其中所述可裂解的键的裂解使添加的核苷酸脱保护以产生脱保护的延伸产物。

16.权利要求15所述的方法，还包括在所述添加的核苷酸脱保护之后：

用第二结合物孵育所述脱保护的延伸产物，其中所述第二结合物是权利要求1-9中任一项所述的结合物，并且所述孵育在其中聚合酶催化第二结合物的核苷酸共价添加到脱保护的延伸产物的3’端上的条件下完成。

17.权利要求11-16中任一项所述的方法，其中所述方法包括：

(a)在其中聚合酶催化第一结合物的核苷酸共价添加到核酸的3’羟基上的条件下，用权利要求1-9中任一项所述的第一结合物孵育核酸，以制备延伸产物；

(b)裂解所述接头的可裂解的键，从而从延伸产物释放聚合酶并使延伸产物脱保护；

(c)在其中聚合酶催化第二结合物的核苷酸共价添加到延伸产物的3’端上的条件下，用权利要求1-9中任一项所述的第二结合物孵育脱保护的延伸产物，以制备第二延伸产物；

(d)对第二延伸产物重复步骤(b)-(c)多次，以产生限定序列的延伸的核酸。

18.权利要求17所述的方法，其中所述核苷酸是可逆终止子，并且其中所述延伸产物的脱保护包括去除可逆的终止子的阻断基团。

19.权利要求11所述的方法，其中所述核酸是寡核苷酸。