[发明专利]用于检测基因突变的方法

说明书

本发明的一个目的是提供一种用于设计引物的新方法，该引物确保了在基于ASP‑PCR方法检测单碱基置换的方法中的反应性和鉴别力，并且提供一种用于容易地检测重叠扩增子内的多个点突变(特别是两个相邻单碱基置换)的方法。通过使用其中始自3’末端的第三个核苷酸的碱基对应于核酸样品中含有的单碱基置换的突变核苷酸的碱基、其中始自3’末端的第二个核苷酸的碱基不与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补、并且其中其他核苷酸的碱基与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补的突变引物，可以容易地检测单碱基置换。

技术领域

本发明涉及用于特异性检测核酸样品中含有的特定单核苷酸多态性(SNP)或点突变的方法。

背景技术

基因突变包括基因遗传性种系突变和在各细胞中获得和诱导的体细胞突变，并且据报道，种系突变中特定基因的特定单核苷酸多态性(SNP)和作为代表性体细胞突变的点突变(单核苷酸突变)与各种疾病相关，并且近年来，将这些突变的检测用于筛选预期某种药物对其有效的患者。

例如，发现当在患者的KRAS基因和NRAS基因的外显子2、3、4区域中发现点突变时，用作结肠癌治疗剂的抗-EGFR抗体预期没有治疗效果，并且开发了一种试剂盒用于能够检测与KRAS基因和NRAS基因的密码子12、13、59、61、117和146处的总共48个氨基酸置换相关的RAS(KRAS/NRAS)基因突变(非专利文献1)。RAS中的点突变的特征在于由三个碱基组成的各密码子处的点突变的位置的多样性，并且需要检测极大数量的单碱基置换类型。

进行EGFR基因突变测试用以判断作为肺癌治疗剂的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的功效。EGFR基因突变的特征在于发现了各种形式的突变如缺失、插入和点突变等。在若干点突变中，在外显子18的密码子719处发生的点突变导致第2155个碱基G被A或T置换，或者第2156个碱基G被C置换，导致三种氨基酸置换。当在EGFR基因的外显子20中的密码子790处第2369个碱基C被T置换时，赋予了TKI抗性，而最近新报道了外显子20中的密码子797处的点突变作为赋予针对第三代TKI的抗性的基因突变(非专利文献2)，并且具有两种形式的点突变，其导致第2389个碱基T被A置换，或者第2390个碱基G被C置换。

如上所述，对于一些RAS基因或EGFR基因突变，在一个密码子中出现两个以上点突变的情况下，需要处理单碱基置换的检测，并且突变检测方法理想地为尽可能简单的并且能够确保鉴别力。

用于鉴别这种单碱基置换的代表性方法是ASP-PCR方法，其中等位基因特异性引物(ASP)与聚合酶链式反应方法(PCR)组合。通常设计ASP使得引物的3’末端处的核苷酸对应于SNP的突变(或野生型)核苷酸，并且3’末端与突变(或野生型)模板杂交从而进行延伸，而3’末端不与野生型(或突变)模板杂交使得不进行延伸。根据是否获得由ASP产生的扩增产物来判断存在/不存在单碱基置换。

然而，为了通过3’末端处的仅一个核苷酸的差异来确保鉴别力，需要在反应期间极其严格地控制温度条件等。因此，已经设计了引物设计方法。例如，公开了一种通过使用检测引物方便且准确地检测单碱基置换的方法，所述检测引物在3’末端具有与测试核酸样品中待测试的特定碱基互补的碱基，始自3’末端的第二个碱基处的碱基与测试核酸的碱基互补，并且在始自3’末端的第三个碱基上游的至少一个碱基被这样的碱基(人工错配)置换，该碱基不同于与测试核酸的碱基互补的碱基(专利文献1)。此外，公开了一种能够通过使用野生型引物和突变引物来容易且明确地测定的技术，在野生型引物中，来自野生型引物的3’末端的第二个碱基对应于单核苷酸多态性位点的预期野生型核苷酸，其中从引物的3’末端的第三个碱基至5’末端的碱基之一可以被不与待与染色体或其片段中的引物杂交的链的碱基互补的碱基置换，并且其中引物中的其他碱基与待与染色体或其片段中的引物杂交的链的碱基互补，并且在突变引物中，来自突变引物的3’末端的第二个碱基对应于单核苷酸多态性位点的预期突变核苷酸，其中从引物的3’末端的第三个碱基至5’末端的碱基之一可以被不与待与染色体或其片段中的引物杂交的链的碱基互补的碱基置换，并且其中引物中的其他碱基与待与染色体或其片段中的引物杂交的链的碱基互补(专利文献2)。