[发明专利]用于检测基因突变的方法

权利要求书

1.一种通过利用核酸扩增反应来检测单碱基置换的方法，所述单碱基置换是核酸样品中含有的单核苷酸多态性位点处的单碱基置换，所述方法将以下步骤结合：

(a)突变引物与所述核酸杂交，在所述突变引物中，始自3’末端的第三个核苷酸的碱基对应于所述单核苷酸多态性的突变核苷酸的碱基，其中始自3’末端的第二个核苷酸的碱基不与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补，并且其中其他核苷酸的碱基与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补；

(b)用DNA聚合酶和作为其底物的脱氧核糖核苷三磷酸延伸所述突变引物；和

(c)基于所述突变引物是否被延伸来检测所述核酸样品中含有的所述单碱基置换。

2.根据权利要求1所述的检测单碱基置换的方法，其中所述单核苷酸多态性位点是第一和第二相邻单核苷酸多态性位点，并且其中步骤(a)是突变引物与所述核酸杂交的步骤，在所述突变引物中，始自3’末端的第三个核苷酸的碱基对应于第一单核苷酸多态性的突变核苷酸的碱基，其中始自3’末端的第二个核苷酸的碱基不与具有所述第一单核苷酸多态性的突变核苷酸的核酸的相应核苷酸的碱基互补，其中始自3’末端的第二个核苷酸的碱基对应于第二单核苷酸多态性的突变核苷酸的碱基，其中始自3’末端的第三个核苷酸的碱基不与具有所述第二单核苷酸多态性的突变核苷酸的核酸的相应核苷酸的碱基互补，并且其中其他核苷酸的碱基与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补。

3.根据权利要求1或2所述的检测单碱基置换的方法，其中所述单碱基置换是EGFR基因、KRAS基因或NRAS基因的单碱基置换。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应。

5.根据权利要求4所述的方法，其中基于存在或不存在所述聚合酶链式反应的扩增产物来确定所述突变引物是否被延伸。

6.一种含有突变引物的试剂，其用于通过利用核酸扩增反应来检测核酸样品中含有的单核苷酸多态性位点的单碱基置换的方法，所述试剂含有的突变引物中始自3’末端的第三个核苷酸的碱基对应于所述单核苷酸多态性的突变核苷酸的碱基，始自3’末端的第二个核苷酸的碱基不与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补并且其他核苷酸的碱基与所述核酸的相应核苷酸的碱基互补。

7.根据权利要求6所述的试剂，其中所述突变引物扩增EGFR基因、KRAS基因或NRAS基因的突变等位基因。

8.根据权利要求6或7所述的试剂，其中所述核酸扩增反应是聚合酶链式反应。

9.一种扩增核苷酸片段的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)将第一引物和第二引物与样品中含有单核苷酸多态性位点的脱氧核糖核酸(DNA)分子杂交；

(ii)在脱氧核糖核苷三磷酸的存在下用DNA聚合酶延伸所述第一引物和所述第二引物；

(iii)将所述第二引物与被延伸的第一引物杂交并且将所述第一引物与被延伸的第二引物杂交；

(iv)在脱氧核糖核苷三磷酸的存在下用DNA聚合酶延伸与被延伸的第一引物杂交的所述第二引物和与被延伸的第二引物杂交的所述第一引物；和

(v)任选地重复步骤(iii)和(iv)一次至50次，优选5至45次，10至45次，10至40次，10至35次，15至35次，20至35次，或25至35次，其中

所述第一引物的核苷酸序列与所述DNA分子的一条链互补，始自3’末端的第三个核苷酸的碱基对应于表征所述单核苷酸多态性的一个基因型的碱基，而始自3’末端的第二个碱基不与DNA链的相应核苷酸的碱基互补，其中

所述第二引物的核苷酸序列与所述DNA分子的另一条链互补，并且其中

当与所述样品中含有单核苷酸多态性位点的脱氧核糖核酸(DNA)分子杂交时，从其他引物的3’末端看，所述第一引物和所述第二引物的3’末端各自位于3’侧。

10.根据权利要求9所述的扩增核苷酸片段的方法，其中所述单核苷酸多态性位点是第一和第二相邻单核苷酸多态性位点，并且其中所述第一引物的核苷酸序列与所述DNA分子的一条链互补，始自3’末端的第三个核苷酸的碱基对应于表征第一单核苷酸多态性的一个基因型的碱基，而始自3’末端的第二个碱基不与DNA链的相应核苷酸的碱基互补，并且始自3’末端的第二个核苷酸的碱基对应于表征第二单核苷酸多态性的一个基因型的碱基，而始自3’末端的第三个碱基不与DNA链的相应核苷酸的碱基互补。