[发明专利]FLAG标记的CD19-CAR-T细胞

说明书

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)‑T细胞，其被修饰以表达CAR融合蛋白，该融合蛋白从N端到C端包含：(i)包含V_H和V_L的单链可变区片段(scFv)，其中scFv具有抗肿瘤抗原CD19的活性，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域；其中该融合蛋白还包含一FLAG标签，该FLAG标签位于scFv的C端。利用CD19‑FLAG CAR‑T细胞替代CD19CAR‑T细胞，输入CAR‑T细胞引起的细胞因子水平(干扰素‑γ，IL‑2和IL‑6)下降。

序列表、表格或计算机程序的引用

序列表通过EFS-Web，以ASCII格式的文本文件与说明书同时提交，文件名为“序列表.txt”，创建日期为2017年3月27日，大小为9,6千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，在此通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本发明涉及一种嵌合抗原受体和表达该嵌合抗原受体的T细胞，可应用于肿瘤的过继免疫基因治疗领域。本发明具体涉及FLAG标记的CD19-CAR-T细胞。

背景技术

免疫治疗逐渐成为一种非常有前途的治疗癌症的方法。T细胞或T淋巴细胞是免疫系统的武装力量，能够持续性地寻找外来抗原、辨别正常细胞和非正常细胞(癌症或感染细胞)。用CAR对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞的常见方案。将靶向肿瘤相关抗原的CAR-T细胞输入患者(称为过继细胞转移或ACT)，代表了一种有效的免疫疗法。与化疗或抗体技术相比，CAR-T技术的优点在于重编程的T细胞可以增殖并在患者体内持续存在，像活的药物一样起效。

CAR(嵌合抗原受体)通常包括一个单克隆抗体衍生的单链可变区片段(scFv)，通过铰链和跨膜结构域连接到可变数目的胞内信号结构域和单个胞内激活CD3-ζ结构域。

图1显示了CAR从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)到第三代CAR(具有多个共刺激结构域)的演变，参见Golubovskaya,Wu,癌症,2016Mar 15；8(3)。生成的具有多个共刺激结构域的CAR(第三代CAR)会产生增加的细胞溶解活性，并显着改善CAR-T细胞的持续性，表现出增强的抗肿瘤活性。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞可以在对标准疗法无反应的血液恶性肿瘤中产生持久的缓解。然而，CART细胞的使用受到潜在的严重毒性的限制。CART细胞治疗后出现意外器官损伤和死亡的早期病例报告首次突显了这种新治疗的可能危险。CAR T细胞可能通过特异性靶向在正常组织上也表达的肿瘤相关抗原，而潜在地损害这些组织。细胞因子释放综合征(CRS)是由输入的CAR T细胞释放的细胞因子引起的全身性炎症反应，可导致广泛的可逆性器官功能障碍。CRS是最常见的CART细胞引起的毒性类型。(Blood.2016；127(26)：3321-3330)在CRS中，如果不进行治疗，全身性炎症反应可导致死亡(Bonifant等，2016，Mol TherOncolytics 3,16011)。CRS患者经历发烧，低血压，缺氧和神经系统疾病，可能需要积极的医疗支持(Davila等，2014，Sci Transl Med 6,224ra225)。

毒性降低的改进的过继T细胞免疫疗法是需要的，因为减少CRS对于临床非常重要，以减少不良反应。

附图简要说明

图1显示了第一代至第三代CAR的结构。

图2显示了非CD19，CD19和CD19Flag CAR构建体的结构。缩写：L，连接子；H，来自CD28的铰链区；TM，来自CD28的跨膜结构域；F，FLAG表位。

图3显示CD19-FLAG CAR-T细胞表现出与CD19CAR-T细胞相当的扩增。Mock CAR-T细胞，CD19CAR-T细胞和CD19-FLAG CAR-T细胞体外扩增100倍。图中显示了来自三个独立实验的代表性生长曲线。