[发明专利]乙型肝炎病毒CCCDNA的定量测量

说明书

乙型肝炎病毒(HBV)感染导致病毒基因组DNA进入宿主肝脏细胞中。该病毒松弛环状DNA(rcDNA)被转运到细胞核中并转化为共价闭合环状DNA(cccDNA)，所述共价闭合环状DNA作为病毒转录的模板。需要消除cccDNA来治愈HBV感染，这仍然是一个主要的治疗挑战。测量本文所述的cccDNA的稳健且灵敏的方法对于促进药物开发和监测疗法功效是有用的。设计一组引物与病毒DNA的亚硫酸氢钠处理组合，允许cccDNA的特异性扩增而不干扰rcDNA的扩增。该方法可用于进一步指导治疗发展，并提供一种监测经历抗病毒治疗的HBV感染患者的非侵入性的替代方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年2月15日提交的美国临时申请No.62/295,481的优先权，其内容在此通过引用以其整体并入本文。

以电子形式提交的序列表的参考

随同一起提交的以电子形式提交的序列表的内容，文件名cccDNA_SeqListing_PCT.txt，大小11,609字节；创建日期2017年2月15日，通过引用以其整体并入本文。

技术领域

本公开一般涉及用于检测或定量(例如，乙型肝炎病毒(HBV)的)闭合共价环状DNA(cccDNA)的方法和试剂盒，并且更具体地涉及用于检测或定量HBV感染的生物样品中区别于松弛环状DNA(rcDNA或RC-DNA)的cccDNA的方法。

背景技术

HBV感染是全球公共卫生问题。全世界有2.4亿人长期感染HBV(Lavanchy和Kane2016)。感染HBV引起急性和慢性肝炎，导致肝硬化和肝细胞癌(Kew MC 2010)。

目前针对HBV感染的疗法是有限的，仅抑制病毒血症而不完全消除病毒，这主要是由于cccDNA的持久性所致(Tang,Yau等人2014)。疗法的停止导致大多数患者反弹，这表明存在导致持续感染的病毒残余物(Abdelhamed,Kelley等人2002)。在经历抗病毒疗法且不继续治疗的患者中，HBV可以自cccDNA中重新活化(Petersen J 2007)。为了监测肝脏中cccDNA的持久性，需要重复的肝脏活检，这对患者来说是危险的、不舒服的和昂贵的(Wu,Johnson等人2014，Zhong,Hu等人2014，Shi,Sun等人2015)。由于cccDNA特别是在肝脏损伤后也可以在血液中发现，其在血清或血浆中的检测允许评价抗病毒疗法的功效和肝脏损伤的程度，而无需借助肝脏活检(Wong,Yuen等人2004，Takkenberg,Zaaijer等人2009)。

在HBV感染后，病毒DNA被转移到感染的肝细胞的细胞核，其中rcDNA被释放到宿主细胞质中。病毒DNA最终被转运到核质中，在那里它被转化为cccDNA。假设作为微染色体，宿主细胞核中cccDNA的存在被用作为肝细胞核质中信使RNA的连续病毒体转录的模板(Levrero,Pollicino等人2009，Nassal 2015)。因此，cccDNA的持久性仍然是仍然具有发展晚期肝脏疾病的风险的慢性感染者中传统抗病毒疗法清除HBV的一个障碍。有趣的是，通过单独的常规抗病毒疗法清除HBV S-抗原(HBVsAg)的患者百分比很小，这表明可以消除cccDNA(Tavis,JE等人2013)。如果可以测量其cccDNA水平，这种治愈的群体可以停止终生的抗病毒疗法，这种疗法成本高且具有未知的副作用。因此，非常需要用于定量来自肝脏活组织或体液的cccDNA水平的灵敏且有特异性的方法来鉴定该治愈的群体。

消除cccDNA是在寻找治愈HBV感染的HBV药物开发研究的最终目标。非常需要一种用于定量cccDNA的灵敏且有特异性的方法。

发明概述

本公开提供了一种用于检测或定量含有cccDNA和非cccDNA的DNA样品中的闭合共价环状DNA(cccDNA)的方法和试剂盒。

在第一方面，公开了一种方法。该方法可以包括以下步骤：