[发明专利]乙型肝炎病毒CCCDNA的定量测量

权利要求书

1.用于检测或定量DNA样品中的闭合共价环状DNA(cccDNA)的方法，所述DNA样品含有cccDNA和与所述cccDNA具有基本上相同的DNA序列且与所述cccDNA呈不同形式的非cccDNA，所述方法包括：

i)处理DNA样品以消除经处理的DNA样品中的双链DNA分子的互补特征并从而防止双链DNA分子的两条链复性；和

ii)对所述经处理的DNA样品进行扩增测定，使得所述cccDNA能产生扩增的产物，但非cccDNA不能产生扩增的产物。

2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤i)中，所述DNA样品用化学试剂处理，所述化学试剂被配置为改变所述经处理的DNA样品中的所述双链DNA分子的两条链的序列并从而消除所述双链DNA分子的两条链的互补特征。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述化学试剂通过引起脱氨基反应起作用。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述脱氨基反应对于特定核苷酸是有选择性的。

5.如权利要求1所述的方法，其中步骤ii)中的所述扩增测定用一对引物进行，所述引物被配置为分别与所述DNA序列上的两个策略性位置退火并且一起被配置为能够从所述cccDNA产生扩增的产物，但不能从非cccDNA产生扩增的产物。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述两个策略性位置分别在所述非cccDNA中的不连续链的已知不连续区的两侧。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述引物对被配置为分别与所述经处理的DNA样品中的连续链的两个策略性位置退火，并从而从所述经处理的DNA样品中的连续链产生扩增的产物。

8.如权利要求7所述的方法，其中步骤ii)中的扩增测定包括实时聚合酶链式反应(PCR)，其被配置为基于所述扩增的产物定量所述cccDNA。

9.如权利要求7所述的方法，其中进一步用探针进行步骤ii)中的所述扩增测定，所述探针被配置为与所述经处理的DNA样品中的连续链退火，但不与不连续链退火，并且被配置为允许对所述cccDNA进行定量。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述探针分别在5'端和3'端处用荧光染料和荧光猝灭剂标记，其分别被配置为允许通过测量荧光强度来对所述cccDNA进行定量。

11.如权利要求1所述的方法，其中：

所述cccDNA包括乙型肝炎病毒(HBV)的cccDNA形式；以及

所述非cccDNA包括HBV的松弛环状DNA(rcDNA)形式。

12.如权利要求11所述的方法，其在步骤i)之前进一步包括：从生物样品获得所述DNA样品，其中所述生物样品是组织或体液。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述体液是血清、血浆、血液、尿液或唾液。

14.用于检测或定量DNA样品中的闭合共价环状DNA(cccDNA)的试剂盒，所述DNA样品含有cccDNA和与所述cccDNA具有基本上相同的DNA序列且与所述cccDNA呈不同形式的非cccDNA，所述试剂盒包括：

化学试剂，其被配置为消除由其处理的所述DNA样品中的双链DNA分子的互补特征并从而防止双链DNA分子的两条链的复性；和

一对引物，其包括正向引物和反向引物，并且被配置为分别与所述DNA序列上的两个策略性位置退火且一起被配置为能够从所述cccDNA产生扩增的产物但不能从所述非cccDNA产生扩增的产物。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述化学试剂包括亚硝酸、亚硝酸钠、亚硝胺或亚硫酸氢钠中的至少一种。