[发明专利]靶标序列中所需核酸区的选择性扩增

说明书

提供了用于在两阶段聚合酶链式反应中选择性扩增所需的扩增子的方法和试剂盒。所述方法和试剂盒使用包含错配控制序列的靶标引物；其中位于所需的扩增子序列侧翼的任何引物对具有非匹配错配控制序列，并且位于非所需的扩增子序列侧翼的任何引物对具有匹配的错配控制序列。

公开领域

本公开内容属于核酸分析领域，特别涉及聚合酶链式反应和随后的大规模平行测序。

背景

几十年来，双脱氧DNA测序(“桑格(Sanger)”测序，Sanger等(1977)，ProcNatlAcad Sci USA 74:5463–5467)已被用作大多数基因实验室中的标准测序技术。使用桑格测序时，通量受到限制，因为该过程是对靶序列的单个分子进行的。寻求更快，更便宜和更准确的测序方法(这些方法增加了高通量的优势)导致了目前称为“大规模平行测序”(massive parallel sequencing，MPS)或“下一代测序”(next-generation sequencing，NGS)的若干种新技术的发展。

MPS方法的引入改变了DNA测序的范例(Mardis(2008),Trends Genet 24:133–141；Shendure&Ji(2008),Nat.Biotechnol 26:1135–1145)。MPS方法能够平行处理数十万到数百万个DNA模板，从而产生高通量和生成序列的每个碱基的低成本。MPS方法的引入还允许用户快速测序整个复杂基因组，例如人类基因组。

然而，整个复杂人类基因组的完全大规模常规测序对于诊断用途尚不可行，因为成本和时间仍然太大。用于诊断用途的人类基因组的常规测序需要每个核苷酸至少100-1000倍的覆盖，导致需要对每个患者测序和处理300-3000 Gb的测序数据。使用可用的MPS方法，这将需要若干次测序运行/患者并且花费数万美元。除了经济负担之外，还需要大量的数据处理和数据存储能力，这将给基因实验室的信息基础设施带来沉重的负担。

因此，旨在简化该过程并富集感兴趣区域用于例如测序的若干种方法即靶标富集方法已经被开发。靶标富集方法用于定义可在测序前从DNA样品中选择性捕获和富集的基因组区域。仅对那些富集的基因组区域进行重新测序比全基因组测序更具时间和成本效益，并且得到的数据分析相当简单，并且需要较低的数据存储能力。

已知的靶标富集方法包括分子倒置探针(MIP)，阵列上-和溶液中-杂交捕获和聚合酶链式反应(PCR)。每个都在下面单独讨论。

分子倒置探针(MIP)：MIP是修饰的锁式探针。当探针与相应的基因组靶标杂交时，在一个或多个核苷酸位置处存在缺口。在例如单核苷酸多态性(SNP)位置中探针缺乏互补核苷酸的设计可用于检测和鉴定多态性。如果杂交探针的缺口超过单个核苷酸，则探针通常称为“连接器倒置探针”(CIP)。使用这种探针的优点是它们可用于SNP基因分型，拷贝数变异(CNV)分析和检测等位基因失衡。可以设计探针使得它们含有用于鉴定探针的标签序列，以及用于测序靶标区域的引物序列。与其他靶标富集技术相比，分子倒置探针显示出良好的特异性，但可能在测定中显示不同探针之间的性能的一些变化。

阵列上和溶液内杂交捕获：如果对使用溶液内捕获技术捕获基因组区域感兴趣，可以使用许多寡核苷酸(探针)并将它们杂交到溶液中的片段化基因组DNA(与基于杂交或阵列的方法相反)。可以将与顺磁珠连接的探针与感兴趣的DNA杂交。杂交后，可以分离含有探针和互补DNA片段的小珠，并通过洗涤小珠除去未结合的DNA材料。从小珠移除后，可以使用桑格测序或MPS方法对DNA进行测序。与基于阵列的技术相比，该技术的一个优点是由于高探针/靶标比率而改善的靶标富集。然而，这可能会对降低MPS成本的尝试产生影响。