[发明专利]靶标序列中所需核酸区的选择性扩增

权利要求书

1.用于在两阶段聚合酶链式反应中选择性扩增所需的扩增子的方法，其包括以下步骤：

提供靶标遗传物质；

使所述靶标遗传物质变性；

在允许引物与所述靶标遗传物质退火的条件下添加一组靶标引物；

所述靶标引物组中的每种引物包含

靶标特异性序列

错配控制序列，和

通用杂交序列；

所述通用杂交序列在每个靶标引物中是相同的；

所述错配控制序列和通用杂交序列彼此紧邻；并且

所述靶标引物组包含至少两个引物对，所述引物对适于扩增所述靶标遗传物质中至少两个重叠的所需的扩增子，使得有可能在重叠区域中获得至少一个非所需的扩增子；

所述靶标引物组的进一步特征在于，位于所需的扩增子序列侧翼的任何引物对具有非匹配错配控制序列，而位于非所需的扩增子序列侧翼的任何引物对具有匹配的错配控制序列；

进行第一多重聚合酶链式反应，产生与第一组引物中引物的不同的可能的成对的组合相对应的重叠的扩增子，所述重叠的扩增子保持在这样的条件下，使得其通过由每个引物中的通用杂交序列产生的互补序列之间的碱基对偶联而自杂交；

在选择条件下处理所述重叠的扩增子，所述选择条件使得所需的扩增子由于由非匹配错配控制序列产生的非互补序列而变性，而非所需的扩增子由于由匹配的错配控制序列产生的额外互补序列而保持自杂交；

添加通用引物，其各自包含与通用杂交序列互补的序列；

进行第二聚合酶链式反应，导致所需的扩增子的选择性扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二聚合酶链式反应在不同的反应容器中进行。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二聚合酶链式反应在同一反应容器中进行。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中在所述第一多重聚合酶链式反应之前加入所述靶标引物，并且在所述第一多重聚合酶链式反应之后并且在所述第二聚合酶链式反应之前加入所述通用引物。

5.根据权利要求3所述的方法，其中在所述第一多重聚合酶链式反应之前加入所述靶标引物和通用引物。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标引物组中靶标引物的总长度为7至200个核苷酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述错配控制序列的长度为1至7个核苷酸。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用杂交序列的长度为1至75个核苷酸。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶标特异性序列的长度为5至100个核苷酸。

10.根据权利要求1所述的方法，其中至少一对中的至少一个引物被可检测地标记。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用引物还包含用于测序所述所需的扩增子的衔接序列。

12.根据权利要求11所述的方法，其还包括对所述所需的扩增子进行测序的步骤。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述测序使用大规模平行测序进行。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述通用引物还包含索引序列。

15.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个靶标引物与靶标遗传物质中的诊断序列互补。