[发明专利]一种改进的启动子及其组成的T载体和应用

说明书

本发明属于基因工程领域，涉及一种改进的启动子及其应用，所述改进的启动子为将启动子区域中的‑35区至‑10区之间的核酸序列突变为核酸内切酶识别位点。本发明能够克服由于采用蓝白筛选的载体存在强启动子启动外源基因的转录或翻译产物可能对宿主有毒性而导致无法克隆的问题，可以避免载体在酶切位点缺失1‑2bp导致lacZα基因移码突变产生假阳性克隆的缺陷，可以消除由于外源DNA片段较小并且外源DNA的插入没有改变lacZα基因的读码框，造成平板都是蓝斑的假阴性现象。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种改进的启动子及其组成的T载体和应用，具体涉及一种改进的启动子、带有所述改进启动子的T载体，带有所述T载体的宿主细胞及其应用。

背景技术

PCR技术的发明是分子生物学与基因工程领域的重大突破。PCR技术诞生之后，将PCR产物克隆入载体(通常为质粒)的技术也获得发展。常用且相对简单的克隆方法包括TA克隆和平末端连接。由Taq酶扩增出的PCR产物含有dAMP尾巴，在T4连接酶的作用下，可以和含有T末端的载体(T载体)连接，这就是TA克隆。而高保真DNA聚合酶通常含有3’-5’核酸外切酶活性，它们扩增出的PCR产物为平末端，将这些片段与切成平末端的载体在T4连接酶的作用下连接就是平末端连接。这两种方法的共同特点是不需要事先用特殊的酶对PCR产物进行处理，而是直接连入载体，具有简单易操作的特性。

目前商业化的T载体和可以用于平末端克隆的载体通常是基于蓝白斑筛选的原理，蓝白斑筛选是最常用的将空载体和有插入片段的载体相分开的一种筛选方案。在这种方法中，报告基因LacZα作为蓝白斑筛选的标记基因，然而基于蓝白斑筛选原理的载体在克隆时有以下问题：(1)由于使用强启动子，能够大量启动外源基因的转录、翻译，导致了某些结构复杂的外源基因转录或翻译产物对宿主有毒性而无法克隆；(2)酶切载体时由于限制性内切酶残留的外切酶活性、酶切载体的反复冻融以及酶切线性化载体的长期保存等因素使得制备的载体在酶切位点缺失1-2碱基，导LacZα基因的移码突变，使得不含外源基因的克隆由于LacZα基因的移码突变而显白色，导致产生大量假阳性克隆；(3)在克隆外源DNA小片段并且外源DNA的插入没有改变lacZα基因的读码框时会造成平板都是蓝斑的假阴性现象；(4)载体在平末端克隆大于2kb的外源DNA片段时，白斑会很少，而蓝斑却很多，而且本来就很少的白斑还可能与蓝斑长在一起，使得白斑单克隆极少，挑选足够数量的阳性克隆会很困难。此外，蓝白斑筛选还需要用到X-gal和IPTG等昂贵且有毒性的化学物质。

CN 101503698 A公开了一种无假阳性T载体及制备方法，所述T载体是一种两个3’端均具有1个突出的dT的线性化质粒载体，所述T载体供插入3’端突出一个dA的PCR片段的位点，即线性化T载体的两个末端，位于阳性克隆筛选标记基因起始密码子与其上游的核糖体结合位点之间，该发明设计构建的T载体在用于克隆PCR片段时，不会因为T载体自连导致的阳性克隆筛选标记基因移码而产生假阳性克隆。但是，如果插入片段不是很长、序列含有ATG起始密码子，并且ATG起始密码子与插入位点上游的RBS距离在8±3bp范围内，就会从插入序列的起始密码子开始进行翻译，如果翻译的ORF和筛选基因的ORF一致，就会融合表达筛选基因，这样就会产生假阴性现象，不仅如此，其不能避免外源基因的转录，会出现强启动子启动外源基因的转录或翻译产物对宿主有毒性而导致无法克隆的问题。

任何一段能够独立与转录因子结合并起始转录的DNA序列都可以被称为启动子。在启动子中，能够被σ因子识别的区域具有非常保守的序列特征。其中，在转录起始位点(+1)上游大约10nt以及35nt处的两段序列(称为-10区与-35区)对于σ因子的识别具有决定性的作用，因此这两段序列也被称作狭义启动子或核心启动子。除这段核心启动子区域之外，-35区的上游序列也可能对转录的强度产生影响，这些序列被称作UP元件(UPelement)。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中制备的T载体无法克隆，或产生大量假阳性或假阴性克隆，从而提供一种改进的启动子及其组成的T载体和应用。