[发明专利]一种改进的启动子及其组成的T载体和应用

权利要求书

1.一种改进的启动子，其特征在于，所述改进的启动子为将β-半乳糖苷酶的启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列突变为核酸内切酶酶切形成平末端序列的识别位点；

所述β-半乳糖苷酶的启动子区域中的-35区至-10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

所述核酸内切酶为EcoRV、AleI、PmlI、AfeI、NruI、PsiI、ScaI、SmaI、SspI或StuI中的任意一种或至少两种的组合；

所述改进的启动子的-35区至-10区之间的核酸序列如SEQ ID NO.3-13所示。

2.一种克隆载体，其特征在于，包括如权利要求1所述的改进的启动子。

3.根据权利要求2所述的克隆载体，其特征在于，所述克隆载体为pUC18、pUC19、pUC57、pCA、pCK、pCC或pCC1中的任意一种或至少两种的组合。

4.一种T载体，其特征在于，所述T载体为将权利要求3所述的载体制备成线性化载体后，在所述线性化载体的3’端添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸得到。

5.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体在权利要求4所述的T载体上插入外源基因；

所述外源基因可操作地连接在所述改进的启动子的核酸内切酶识别位点之间。

6.一种如权利要求4所述的T载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)根据要突变的核酸内切酶识别位点设计引物，以原启动子及其调控表达的基因为模板，进行PCR扩增，获得带有改进的启动子的产物；

(2)用Gibson重组的方法将步骤(1)的产物进行环化，得到带有启动子的载体；

(3)将步骤(2)所述载体进行线性化；

(4)在步骤(3)所述线性化的载体的3’端添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸，得到所述T载体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述引物的核酸序列如SEQID NO.14-35所示；

步骤(3)所述线性化为核酸内切酶酶切和/或PCR扩增获得；

步骤(4)所述添加1个双脱氧胸腺嘧啶核苷酸采用末端转移酶和/或Taq DNA聚合酶；

步骤(1)之前还包括将调控表达的基因进行密码子优化；

所述调控表达的基因为lacZα基因，其核酸序列如SEQ ID NO.36所示；

所述lacZα基因进行密码子优化，其密码子优化后的核酸序列如SEQ ID NO.37所示。

8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3所述的载体或如权利要求5所述的重组载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌；

所述大肠杆菌仅编码β-半乳糖苷酶C端ω片段。

10.一种基因克隆的方法，其特征在于，包括如下步骤：

将外源基因的3’端添加1个A碱基，添加A碱基的外源基因与权利要求4所述T载体连接，导入宿主细胞中，在合适的条件下，培养所述宿主细胞，以便获得阳性克隆。

11.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的改进的启动子、权利要求2或3所述的载体、权利要求4所述的T载体、权利要求5所述的重组载体或权利要求8或9所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。

12.权利要求11所述的试剂盒在基因克隆中的应用。