[发明专利]一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法

说明书

本发明涉及一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成组织段；剥离华通胶，将华通胶剪成块状；向块状组织中加入冻存液，先后在4℃下冷藏0.5小时，‑20℃冷藏2小时，‑80℃下冷冻1天，最后液氮中冷冻备用；需要时将块状组织从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用无血清培养基清洗组织后，直接接种至明胶铺被的培养皿中制备间充质干细胞。本发明方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够进行自我更新、多分化潜能的多能干细胞，可以向神经细胞、心肌细胞、肌细胞等多种终末组织器官的细胞分化，其在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。

脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，有两条动脉和一条静脉。研究显示，在脐带血管和内壁之间含有疏松的胶状物质(称为华通胶)，该胶状物质里含有丰富的脐带间充质干细胞。从脐带分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大降低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因使得脐带间充质干细胞成为研究的热点。

但是，脐带组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份脐带组织的处理和干细胞制备培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将脐带组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞制备的做法相对更符合成本效益。并且在制备MSCs时使用含血清培养基，虽然可以在较短时间内大量扩增MSCs，但动物血清所带来的异源性污染可为临床MSCs的应用带来风险。因此，无血清培养基越来越受到关注。相比起来，无血清培养基成分确定，批次稳定，更容易实现细胞应用中的安全性和可控性。但目前无血清培养基存在的普遍问题在于对原代细胞的贴壁和生长支持能力不足。

因此，本领域需要一个简单、高效、无污染的脐带组织冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法。

本发明第一方面提出一种脐带组织块冻存、复苏以及制备间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)用消毒液对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，用缓冲液清洗脐带组织；

(2)将步骤(1)获得的脐带组织剪成组织段；

(3)剥离所述组织段的华通胶，将华通胶置于洁净的离心管内，用手术剪剪成块状；

(4)向所述块状组织中加入无血清培养基，无血清培养基的体积为所述块状组织体积的二分之一，重悬块状组织后加入与无血清培养基等体积的预冷冻存液，分装至冻存管中；

(5)将步骤(4)获得的含有块状组织的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时，-20℃冷藏2小时，-80℃下冷冻1天，最后在-196℃液氮中冷冻备用；

(6)需要时将步骤(5)冷冻的块状组织从液氮中取出，在恒温水浴中解冻，用移液管吸取解冻的组织块，放入洁净的离心管中，加入无血清培养基混匀，然后于低温离心，去掉上清液；

(7)将步骤(6)离心后的块状组织接种至明胶铺被的培养皿中，加入无血清培养基后放入CO₂培养箱内培养；以及

(8)培养后的3～5天进行第一次换液，以后4～5天换一次液。待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代，即获得脐带间充质干细胞。